生物制品质量控制中细菌真菌的污染分析

　　在生物制剂相关洁净区中，各种关键操作和制造步骤都需要在严格的洁净条件下进行，例如病毒培养、细胞培养、菌种发酵、制剂灌装等。洁净室不仅可以降低微生物污染的风险，还能减少交叉污染和产品变质的可能性。这对于生物制药领域来说至关重要，因为生物制品对纯度、活性和安全性的要求非常高。

　　2021年9月美国FDA发布指南草案“Microbiological Quality Considerations in Non-sterileDrug Manufacturing”（非无菌药品生产中的微生物质量考量），对非无菌药品微生物质量属性进行要求，并且对影响非无菌药品微生物质量属性的风险点进行讨论。

　　据统计，2013—2019年中国、美国、澳大利亚、日本和新加坡药品召回事件中，428次召回涉及微生物污染，占药品召回总数的3.86%。在微生物污染相关召回事件中，召回原因包括真菌污染、细菌污染和未知微生物污染，其中未知微生物污染召回209次(48.83%)，即近一半的微生物相关召回并没有明确鉴定污染物种。

　　细菌污染

　　1、细菌

　　细菌是一大类广泛存在的单细胞微生物。细菌直径一般为几个微米，形态多样，例如：球状、杆状和螺旋状。常见的细菌有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。细菌具有独立的生命活动能力，可从外界环境中摄取营养物质，获得能量，具有代谢旺盛、繁殖迅速的特点。

　　细菌的细胞膜具有选择性透过物质的作用，这对保证细菌有一个稳定的内在环境及在生长过程中不断获得各类营养物质十分重要。水及小分子溶质可经过半透膜性质的细胞壁及细胞膜进入菌体。大分子的营养物质如蛋白质、多糖和脂类必须在细菌分泌的胞外酶作用下，分解为小分子可溶性物质后才被吸收。

　　2、细菌的生长繁殖

　　细菌以简单的二分裂方式无性繁殖，其突出的特点为繁殖速度极快。细菌分裂倍增的必须时间，称为代时，细菌的代时决定于细菌的种类又受环境条件的影响，细菌代时一般为20～30分钟，个别菌较慢，如结核杆菌代时为18～20小时，梅素螺旋体为33个小时。

　　3、细菌的代谢

　　各种细菌对生长因子的要求不同，如大肠杆菌很少需要生长因子，而有些细菌如肺炎球菌则需要胱氨酸、谷氨酸、色氨酸、天冬酰胺、核黄素、腺嘌呤、尿嘧啶、泛酸、胆碱等多种生长因子。致病菌合成能力差，生长繁殖过程必需供复杂的营养物质以使其获得相应的生长因子。有些生长因子仅为少数细菌所需，如流行性感冒杆菌需V、X两种因子，而金黄色葡萄球菌生长过程可合成较多的V因子。

　　细菌分泌胞外酶将多糖、蛋白质等大分子营养物质分解为单糖、小肽或氨基酸，然后吸收进入菌体，再经氧化或胞内酶分解形成菌体可利用的成分，此谓细菌的分解代谢。细菌以营养原料及生物氧化产生的能量，合成菌体及相应的代谢产的，此谓合成代谢。细菌在分解和合成代谢中能产生多种代谢产物，在细菌的鉴定及生化反应中有实际意义。

　　4、细菌污染的特点

　　培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。

　　肉眼观察特点：

　　(1)细菌污染初期，细胞培养基可能在4-6小时呈现混浊；

　　(2)细胞死亡脱落，稍加震荡，便会有很多混浊物漂起；

　　(3)细菌大量增殖后，培养基呈现亮黄色混浊状态。【见图1】

　　显微镜下观察特点：

　　(1)细菌在普通倒置显微镜下呈黑色细砂状，或背景有大量黑点，可见菌体持续游动；

　　(2)根据感染菌的种类不同，可能会呈现不同的形状，培养液一般会变得浑浊、黄色，对细胞生长有明显影响。

　　真菌污染

　　1、真菌

　　真菌为真核型微生物，种类繁多，估计有多达150万种，最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。由于青霉素、链霉素等常见抗生素以及实验室消毒用的75%酒精，对细胞中污染的真菌毫无作用，真菌是细胞培养过程中最棘手的污染物之一。

　　2、真菌污染的特点

　　相较细菌而言，真菌的生长就会缓慢许多，其对细胞培养体系的影响也相对较慢，真菌污染短期内培养基不会混浊。但细胞生长会变慢，最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。培养细胞受真菌污染后，会形成白色或浅黄色的肉眼可见的漂浮物，在倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。

　　生物医药和制品生产过程中的洁净和无菌环境对于产品质量的保障至关重要。然而，车间内的霉菌污染问题经常出现，并且可能会引起诸如交叉污染、产品变质甚至员工健康问题。本文将为您介绍解决车间霉菌污染的有效方案，以确保生产过程中的卫生与安全。

　　细菌、真菌污染的控制

　　药品中造成微生物污染的种类，主要决定于制剂原材料及生产环境等，主要的影响因素包括：

　　1.原辅料：原辅料中含动物脏器的药品往往会有革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，并有可能带有沙门氏菌、葡萄球菌等；植物原料，往往会带真菌，如曲霉、青霉、链孢霉、酵母菌等，并可能带有土壤中的各种细菌。

　　2.生产用水：水是药品中微生物污染的重要来源。因除了在配置各类制剂本身需要外，在洗涤及冷却过程均涉及不同的水。水中微生物数量主要由水的来源、处理方法、供水系统状况等决定。各国药典均对药剂的用水品质及规格做出相应规定。

　　3.设备：如维修、保养不及时，生产结束后不进行清洗消毒，可能会带来微生物滞留滋生。如药厂的高压灭菌锅安装不当，导致排气不畅、上下温度不均匀造成灭菌不彻底，可能会造成不可控的损失。

　　4.环境：空气中含各种微生物，种类和数量因环境不同而有很大变化。环境中有活动的人，含菌量就增多；湿度较高时，可促使环境中颗粒沉降，含菌量随之下降，但高湿度可助长真菌生长；在空气最常见的微生物，常是一些抵抗力强且耐干燥的细菌、霉菌及酵母菌。由于空气中含有数量不等的微生物，尤其是通风不良、尘埃多的不良环境，在生产药物制剂时，空气中微生物可能进入原料中，而使药物制剂发生污染，污染的程度与空气中的含菌量有关。

　　5.包装材料：药品需要良好的包装，在保存期内免受微生物污染。各种包装容器如玻璃、塑料、纸制品在使用前都必须彻底消毒，消毒后存放条件也需符合卫生标准。成品放置时间不宜过长。

　　6.人员：在生产过程中，人体的正常微生物亦可随之进入药品中，因此，人是药物生产过程中最大的污染源之一。做好消毒工作很有必要，据报告，洁净室中人员手臂、头轻微动作，每分钟可产生50万个0.3-1.0μm的微粒，而穿连体工作服的发尘量为普通工作服的3%。

　　总结

　　生物制品由于种类繁多，生产工艺复杂，成品成分众多，具有生物活性等特点，易被细菌、真菌等微生物污染，因此无菌检查是药物开发过程中的关键步骤。无菌检查是检查供试品是否有活细菌-真菌的一种方法，以确保产品中不存在明显的活污染微生物。下面的推文我们将详细介绍无菌检查方法--细菌真菌培养法。