荧光假单胞菌菌种介绍及检测方法

　　一、菌种介绍

　　荧光假单胞菌（P.Fluorescens）是一种环境污染菌。对于人类是一种罕见的机会致病菌。荧光假单胞菌属于假单胞菌属，是化能异养型的革兰氏阴性菌，呈杆状，有鞭毛。能分泌黄绿色荧光色素发出荧光，能产生抗生素、水解酶等代谢产物，在4℃-37℃范围内，中性环境中生长，生理生化特性显著，是作为嗜冷菌是牛奶中危害最大的微生物。

　　二、培养基

　　*营养琼脂培养基（NA）

　　*胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）

　　*LB培养基（以上三款培养基任选一种即可）

　　三、保藏条件

　　斜面菌种和安瓿瓶冻干菌种应在2～8°C保存。西林瓶请置于-20°C保存。甘油管请置于-80°C保存;请勿长期置于室温。

　　四、注意事项

　　1）冻干粉首次活化，干粉要全部用完，不能预留，用无菌吸管吸取0.3ml的培养液（即以上建议的培养基配方，不加琼脂）或者无菌水，滴入冻干管中，轻轻振荡至其溶解。吸取全部菌悬液，接种在培养基上（建议不超过2支平板或者斜面，若接种液体培养基，则试管液体不超过5ml为宜）；

　　2）经过冷冻干燥保藏，菌种处于休眠状态，复苏培养时可能会延迟生长，这时需较长的培养时间；若您收到的是已复苏的培养物（非冻干菌），则可以直接用于您的实验，或根据需要转接培养如有不明白之处，请务必先咨询我单位技术人员，避免不必要的损失；3）微生物菌种应保藏于低温、清洁干燥的地方，室温放置时间过长会导致菌种衰退；4）菌种操作应在无菌条件下进行；转种完毕，应经灭菌再做丢弃处理；5）应根据菌种状况及时转接，冻干菌种保藏时间通常为2-25年；

　　6）菌种使用过程中如出现杂菌污染或菌种生产性能下降或不活，请在收到后2个月内和微生物菌种查询网联系，逾期不予受理；

　　7）打管操作需由专业微生物技术人员在相应的防护设备中进行，生物危害程度为三类的菌种应在生物安全柜中操作，打管时冻干管应远离面部，保护眼睛。

　　8）安瓿瓶开封：用浸过75％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，用火焰加热其顶端，滴少量（2-3滴）无菌水至加热顶端使之破裂，用锉刀或者镊子敲下已破裂的安瓿管顶端并将冻干管开口处在火焰上过一遍，并保持在火焰旁操作。

　　9）甘油管使用：使用本甘油菌时可以不用完全融解，在甘油菌表面蘸取少量涂板或进行液体培养即可。也可以完全融解后使用，但随着冻融次数的增加，细菌的活力会逐渐下降。10）西林瓶开封：用75%酒精棉擦拭西林瓶外部，在安全柜内使用尖嘴钳去除塑料盖及铝盖，注意不要同时打开胶塞。缓慢开启胶塞，用75%酒精棉消毒瓶口部分，使用无菌吸管注入0.5ml适宜的液体培养基复溶冻干粉末。

　　五、荧光假单胞菌的检测方法

　　我国对乳制品中嗜冷菌数量的检测采用国家标准NYT 1331-2007中平板计数的方法，对荧光假单胞菌没有专门的国标，但是国内外对荧光假单胞菌检测技术有丰富的研究。

　　平板计数法

　　国际乳品联合会（IDF）采用IDF Standard 101A和IDF Standard 132A检测标准，前者采用6.5℃培养10天后平板计数，后者21℃培养25h后计数，132A培养时间短稳定性好，菌数较为准确。平板计数法将原料乳稀释后，采用涂布法，倾注法，3M细菌总数试纸等方法进行计数，倾注法由于温度较高导致精确度较低，3M试纸精确度和效率较高。平板计数法是传统的检测方法，计数准确，但耗时太长，25h远达不到工业生产快速检测的要求。

　　直接荧光过滤法

　　直接荧光法DEFT（Direct Epifluorescent Filter Technique）是利用电离辐射对食品样品菌落计数的方法，操作简便，具有高通量性。将样品通过过滤器后，吖啶橙染色，在紫外显微镜下活细胞能观察到橘黄色，而死细胞染成绿色，可以统计出样品中所有菌落的总数。原料乳用滤膜过滤后染色，计数得荧光假单胞菌相关性系数为0.91，且在25min内完成检测。相对于传统的平板计数方法，DEFT大大缩短检测时间，利用其原理，可以实现对多种食品中菌落数的快速检测。但是DEFT的灵敏度不高，只能用于检测一定范围内菌落数，当食品中菌数含量较少时没有良好的线性关系，且实验仪器比较昂贵，在工业生产中不能很好的适用。

　　流式细胞法

　　流式细胞法FCM（Flow Cytometry Method）可以检测菌液中标记荧光信号的单细胞，对菌株实现逐一定量分析。流式细胞法检出的菌数是平板计数法的3.8倍，因为能统计到总体菌落数量。利用这个方法检测牛奶中假单胞菌，能在4 h内完成检测，且在菌落数含量较少时灵敏度有很大的提高。此方法可以快速准确的检测原料乳中荧光假单胞菌含量，但流式细胞法操作过程较为复杂，且容易被多种因素影响检测到的结果。

　　PCR法

　　针对16S rRNA保守序列设计引物，通过PCR扩增，可以将牛奶中嗜冷菌扩增出147bp的DNA片段，标记后用ELISA检测，得到荧光假单胞菌AH-70的OD450和菌浓度的方程，分析得此方法和平板计数法的相关系数达到0.94，可以检测菌浓度范围是103-107CFU/mL。PCR检测具有很高的灵敏度，特异性较强，有文献报道当原料奶中埃希肠杆菌的浓度达到10CFU/mL时能被检测出来。PCR检测菌落数结果同样会受到死菌株数的影响，而且在现实生产中对食品提取可以PCR扩增的DNA难度很大，容易被食品体系中因素影响精确度。

　　氨肽酶法

　　氨肽酶法通过革兰氏阴性菌细胞壁上的氨肽酶与特定的化合物反应，检测氨肽酶的活性。吕元等人用氨肽酶法，对杭州地区原料奶中荧光假单胞菌，阪崎肠杆菌和鲁氏不动杆菌3种优势嗜冷菌进行快速检测。结果得出3种菌的浓度和氨肽酶活性存在显著的相关性，且与传统的平板计数法的结果没有显著差异，可以在很大程度上缩短检测的时间。在检测冷藏肉类中嗜冷菌报道，氨肽酶法的检测范围是104-108CFU/mL，检测时间为2.5 h，与平板计数法结果的相关性为0.88。显然氨肽酶法能达到快速检测的效果，氨肽酶法适用于定性检测，可以根据反应颜色用肉眼观察，但检测灵敏度较其他方法差，最大的问题是原料样品中的革兰氏阳性菌无法被检出，导致实验结果偏差。

　　ELISA法

　　ELISA法通过抗体特异性反应检测菌落数，具有高灵敏性，也易于同其他方法结合。PicardC等人通过测定酪蛋白糖多肽计算原料乳中嗜冷菌含量。利用单克隆抗体，检测出成品奶样中嗜冷菌，与平板计数法相关性达0.96。从脱脂奶粉中检测6种沙门氏菌，检出线为10 CFU/mL，检测时间为3h。CrociL等人在对猪肉样品的检测中，将ELISA方法和PCR法、平板计数进行对比，得出前面两者都较为灵敏，最低检出线为1-10个/25g，检测结果符合ISO规定。

　　免疫磁珠法

　　免疫磁珠技术可以快速的富集乳制品中低浓度的菌，通过结合PCR、ELISA等方法可以达到快速、准确的检测目的。吕琦等人通过对4中菌保守序列基因设计引物，建立多重PCR体系，在7-8h检测时间内，检测灵敏度达到102CFU/mL，具有特异性。免疫磁珠技术检测在各个方面都表现出一定优势，改进得到嗜冷菌的保守序列能表现高通量性。对于免疫磁珠技术检测乳制品中菌浓度的研究报道较少，但是应用于检测有害化合物的研究都比较成熟，应用广泛。