小鼠脑周细胞永生化细胞的传代及冻存注意事项

　　一、产品简介

　　1、产品名称：永生化小鼠脑周细胞

　　2、细胞来源：原代小鼠脑周细胞

　　3、产品规格：1×106细胞/T25方瓶

　　4、细胞简介：

　　虽然原代小鼠脑周细胞最更能真实地反映脑周细胞在小鼠体内的生理状态，但是一方面原代分离培养小鼠脑周细胞周期长及对技术人员经验要求较高，另一方面此原代细胞在体外的生长增殖能力非常缓慢有限，以至于此细胞不能多次传代，这些不利因素制约了原代小鼠脑周细胞在实验室的广泛应用。的研究团队拥有多年原代细胞分离培养及细胞永生化服务研究经验，成功建立了永生化小鼠脑周细胞。

　　周细胞是一种包围全身毛细血管和静脉中内皮细胞的细胞，可以收缩。周细胞嵌入毛细血管内皮细胞的基膜中，通过物理接触和旁分泌信号与内皮细胞进行细胞通讯，监视和稳定内皮细胞的成熟过程。在大脑中周细胞帮助维持血脑屏障，周细胞是大脑神经血管单位的重要组成部分。此外，周细胞还具有调控毛细血管血流量、细胞碎屑清除和吞噬以及血脑屏障渗透性的作用。

　　本公司生产的永生化小鼠脑周细胞采用酶解法和SV40T慢病毒制备而来，细胞总量约为1×106/T25方瓶，细胞纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

　　培养基信息：

　　我们推荐使用研制的永生化小鼠脑周细胞完全培养基（DMEM/F12+10%FBS+1%双抗）作为体外培养永生化小鼠脑周细胞的培养基。

　　二、使用方法

　　1、您收到细胞后，请按照以下方法进行操作：

　　取出T25方瓶，75%酒精擦拭培养瓶，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中静置2-3小时，以稳定细胞状态，然后打开瓶子回收瓶子中培养液作为后续培养此细胞的完全培养基（备注：先使用瓶子中完全培养基传代培养，等传代的细胞生长满后冻存保种些种子，另外1瓶细胞继续传代培养，保存种子后再尝试自己完全培养基培养观察是否适合此细胞生长，以免出现使用自己培养液不适合细胞生长造成细胞状态不好或死亡没有细胞种子情况），最后按照后面细胞传代步骤进行细胞传代培养。

　　2、细胞传代：

　　1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS清洗细胞3次；

　　2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化5-8分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分成片脱落，显微镜下用手左右晃动培养瓶使细胞完全脱落，迅速拿细胞回操作台加入5ml此细胞的完全培养基终止消化；

　　3.用滴管轻轻混匀细胞悬液并移入15ml离心管中，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，再加入10mL完全培养液后用滴管轻轻吹打均匀；

　　4.每5ml细胞悬液分装到1个新T25方瓶中进行培养（共2个新T25方瓶）。

　　3、细胞冻存：

　　1.细胞生长至覆盖培养瓶的90%面积时，弃T25方瓶中的培养液，用PBS清洗细胞3次；

　　2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化5-8分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分成片脱落，显微镜下用手左右晃动培养瓶使细胞完全脱落，迅速拿细胞回操作台加入5ml此细胞的完全培养基终止消化；

　　3.用滴管轻轻混匀细胞悬液并移入15ml离心管中，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，用适当量的冻存液（完全培养液：FBS：DMSO=7:2:1）重悬细胞，并放置于冻存管中（每T25瓶细胞建议冻存1管）；

　　4.先将细胞冻存管放置于-20℃1h，然后将其移入-80℃过夜，24h后转入液氮中进行长期储存（或者按照梯度程序降温模式直接放置-80度冻存后并转移液氮中长期储存）。

　　4、细胞复苏：

　　1）从液氮中取出细胞冻存管（注意：佩戴防爆管面具），快速将其置入37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁；

　　2）将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养液无菌离心管中，1000rpm离心5min，然后加入5ml完全培养液混匀细胞，将细胞悬液转移至T25培养瓶中，放置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养；

　　3）第二天，换用新鲜完全培养基继续培养。

　　三、注意事项

　　1、传代或冻存细胞用胰酶消化时，T25瓶子必须使用2mL胰酶量，10cm皿培养的细胞必须使用4ml胰酶量，否则传代的细胞生长过慢或冻存的细胞复苏不贴壁；

　　2、传代或冻存消化细胞要5分钟以上，消化时间低于5分钟会导致后续细胞生长过慢或细胞逐渐死亡或冻存的细胞复苏不贴壁，5-8分钟消化时间不用担心消化过头问题；

　　3、胰酶消化细胞后用手拍打瓶子使细胞完全分散开，然后用滴管轻轻混匀，不推荐使用1mL枪头吹打细胞；

　　4、永生化细胞刚开始推荐按照1:2传代培养，是传代到2个T25瓶子比例，不是2个10cm皿比例。

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