不同动物原代细胞的永生化方法及其应用

　　作为研究基因功能、药物作用机理和疾病发生机理的重要材料，细胞广泛应用于基础科学研究和生物制药等领域，如病毒性疫苗的研究和开发、单克隆抗体的制备和新药的筛选等。根据细胞类型可将其分为原代细胞和传代细胞。原代细胞是指从活体动物器官或组织中新鲜分离出来并在体外立即进行培养的细胞；传代细胞是指原代细胞首次传代成功后持续增殖并可在体外继续培养的细胞。

　　体外培养的原代细胞，因离体时间短，保留了细胞在体内原有的生物学特性和遗传特征，因此可用于进行药物筛选和细胞转染等研究。由于原代细胞分离和培养的成本较高、容易受细菌污染、在体外增殖传代次数有限且较难培养，因此培养一种既不改变正常生物特性又可在体外无限增殖传代的批量化生产的永生化细胞系是必要的。

　　细胞永生化是体外培养细胞受到自发或外界因素的影响，从正常细胞衰老、增殖危机中逃逸，导致其有丝分裂过程和细胞周期检查点的通路失控，端粒酶重新激活后上调，从而获得无限分裂增殖能力的过程。本文主要概述了不同动物细胞永生化的作用机制、方法和研究现状，以期为疫苗生产、抗体生产和基因功能研究等提供参考，为准确诊断疾病提供新思路。

　　1细胞永生化的作用机制

　　目前，已经获得实验证实的细胞永生化机制是关于细胞衰老的“端粒假说”理论。衰老和死亡是细胞正常不可逆的生理过程，将正常人或动物原代细胞经体外多次传代培养后，细胞会失去复制潜力并发生衰老，除干细胞和生殖细胞外，大部分真核生物细胞都具有该特性。已经进入衰老期(即M1期)的细胞对生长因子失去反应，并产生DNA合成蛋白抑制因子，如细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21和p16、肿瘤抑制蛋白p53和衰老相关的β-半乳糖苷酶(Senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-gal)等，细胞周期G1检查点发送停止信号后，DNA合成停止并进行自我修复，细胞增殖被抑制。细胞染色体末端的保护性“帽”——端粒不再稳定，并缩短达到临界水平，细胞停止分裂并发生衰老。然而，病毒、原癌基因和抑癌基因突变体等可激活端粒酶活性，并与视网膜母细胞瘤的磷酸化(Phosphorylation of retinoblastoma,pRB)途径联合作用绕过M1期，使细胞进入增长抑制状态，即危机期(M2期),此时，细胞的端粒变得更短以至于发生染色体末端融合，由此产生的双着丝粒染色体可通过阻断细胞有丝分裂来降低细胞活力，此时绝大部分细胞已发生凋亡，若出现零星细胞存活(概率约1×10-7),可能是激活了其端粒酶活性，以端粒酶自身RNA为模板合成端粒DNA,维持端粒长度，保证了染色体的稳定性，从而可使细胞绕过M2期发生永生化。

　　此外，经历危机期后的永生化细胞分为2类：一类是可检测到端粒酶活性的细胞，另一类是不能检测到端粒酶活性，而是以一种不依赖端粒酶的端粒延长机制，即替代端粒延长(Alternative lengthenging of telomeres,ALT)的方式保持端粒长度稳定的少数细胞。尽管ALT的分子机制尚不清楚，但在酵母中发现，该机制依赖于DNA同源重组。综上所述，细胞永生化的实现需要跨越2个障碍：复制衰老期和危机期，端粒酶、pRB和p53在细胞增殖和永生化中起着关键调控作用。

　　2促使细胞永生化的方法

　　2.1端粒与端粒酶激活

　　端粒位于染色体末端，由富含鸟嘌呤的串联重复序列和蛋白质组成，可保护染色体免受降解、保持稳定。大多数正常体细胞的端粒在其分裂的每个周期中并不完全复制，其末端会逐渐缩短，而且目前尚未发现可以补偿与DNA复制相关的端粒损失的机制，即解决“末端复制问题”。当端粒长度极短时，会诱导DNA损伤反应(DNA-damage response,DDR),如发生细胞凋亡和细胞衰老。因此，端粒被认为是“生物钟”,控制着大多数正常细胞的增殖潜力。然而，在大多数可持续分裂增殖的肿瘤和癌细胞中却发现，其端粒长度较稳定且端粒酶活性异常高，因此推测端粒长度稳定可能受到端粒酶活性和端粒酶逆转录酶(Telomerase reverse tranase,TERT)基因及其他作用机制的调控。

　　端粒酶是一种核糖核蛋白酶复合体，由端粒酶RNA、端粒酶相关蛋白和TERT组成，主要负责端粒长度的延伸。其中，TERT在维持端粒酶活性中发挥关键作用，TERT基因的表达与细胞端粒酶活性呈高度正相关。若将TERT基因导入目的细胞染色体DNA中，可上调其表达，稳定端粒长度，促使细胞发生永生化，表达TERT基因的细胞通常表现接近正常二倍体的核型，也可维持正常细胞的生理特性，如生长速率、核型、无致瘤性和接触生长抑制性等[15],因而是一种非常理想的建立永生化细胞系的方法。

　　研究发现，正常细胞中的端粒酶活性一般处于低表达状态，原因是其催化组分TERT基因在绝大多数非肿瘤细胞中的转录活性被抑制。该基因已被证明可通过激活TERT活性来稳定端粒长度和消除衰老屏障，对细胞永生化和恶性转化至关重要。可在90%的人类原发性癌症中检测到TERT基因/端粒酶活性持续性高表达，说明大多数肿瘤细胞中存在调控TERT基因转录的遗传机制，如启动子突变、基因拷贝数变异和基因组重排等,这些机制可导致TERT表达增加，端粒酶活性增强，从而维持端粒稳定。

　　2.2病毒基因转染

　　虽然通过转染TERT基因维持细胞端粒酶活性的永生化方法已被广泛应用，但与衰老相关的生长抑制因子pRB和p53失活也可能是细胞永生化的重要条件之一。如图1所示，猴空泡病毒40(Simian-virus 40,SV40)、人类疱疹病毒(Epstein-barr virus,EBV)和人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)等病毒基因，在实现细胞永生化方面需要依赖于与生长抑制因子pRB和p53的相互作用。因此，可将这些病毒基因转染到正常原代细胞中建立永生化细胞系。

　　图1 3种病毒基因与pRB和p53相互作用关系

　　SV40是于1960年左右发现的一种猿猴肾细胞DNA病毒，主要由大T(Large T,LT)、小T(Small T,ST)抗原和相关结构蛋白组成。研究表明，将SV40的LT抗原片段整合入宿主细胞，其可结合并抑制包括pRB和p53在内的几种细胞肿瘤抑制基因的表达，同时可通过阻止细胞周期G1/S期和G2/M期的转换，介导正常细胞的转化，使细胞进入无限增殖的生长状态。但转染SV40 LT基因的细胞永生化概率很低，通常只有10-8～10-5。

　　EBV是一类含有双链DNA的病毒，与多种肿瘤发生有关，主要感染B淋巴细胞和口咽上皮细胞。EBV长期潜伏在淋巴细胞中，在潜伏感染期间表达多种潜伏基因，与癌基因相互作用，导致宿主细胞周期紊乱并抑制细胞凋亡，从而促进EBV相关肿瘤的发生。例如，在构成EBV基因组的基因中，编码EBV核抗原-2(EBV nuclear antigen 2,EBNA2)、EBV核抗原-3A(EBV nuclear antigen 3A,EBNA3A)和潜伏膜蛋白-1(Latent membrane protein 1,LMP1)的潜伏基因已被证明是EBV使B淋巴细胞永生所必需的，EBV通过与体外培养的B淋巴细胞融合，使基因组中的潜伏基因与细胞因子相互作用，通过抑制受感染细胞凋亡，促使细胞持续增殖，从而引起基因突变，改变细胞周期，使细胞发生永生化。由于转染EBV基因发生的细胞永生化涉及多个基因和信号通路，如激活B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)基因和核蛋白类原癌基因Myc等，以及核因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylin-ositol-3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)等信号通路和肿瘤抑制因子p53和p16等。目前，EBV感染细胞使其永生化应用最多的例子就是B淋巴细胞，同时也发现，EBV基因存在于某些T淋巴细胞(T-lymphocyte)或自然杀伤(Natural killer,NK)细胞等肿瘤细胞中。但是，该方法目前作用于其他目的细胞的成功率较低。

　　HPV是一种对上皮细胞具有高度特异性的双链DNA病毒，通过转染该病毒基因可诱导上皮细胞增殖成乳头状瘤细胞，永生化概率可达10-5。研究发现，HPV使细胞永生化的机制是HPV E6和E7蛋白联合作用，促使细胞继续增殖和分裂，E6蛋白的永生化活性与p53蛋白的结合和失活有关，而E7蛋白的永生化活性与E2F-Rb复合体的结合和解离有关。E6蛋白还可激活TERT基因，提高端粒酶的表达和活性。研究表明，转染HPV基因的上皮细胞内端粒的长度不断增加，最终可引起细胞增殖失控而实现永生化。

　　2.3可回复性永生化

　　用SV40 LT基因等病毒基因转染，虽然可诱导原代细胞在体外大量增殖而发生永生化，但由于病毒基因在体内长期存在会增加致癌风险,因此可考虑将条件基因敲除技术与基因转染技术相结合，诱导原代细胞发生永生化，此过程也被称为可回复性永生化。该方法的原理是先构建永生化基因和Cre-LoxP序列的重组载体，然后转染入目的细胞，通过筛选阳性克隆扩大培养，最终获得一定数量可在体外长期增殖的永生化细胞系，之后目的细胞可表达Cre重组酶，识别LoxP序列，从而切除永生化基因，使目的细胞恢复到永生化之前的状态[31]。该方法既解决了原代细胞的体外增殖问题，又克服了其所存在的安全性问题和特异性功能分化较差的缺点，因此，该方法目前在人生肌细胞、人肝窦内皮细胞、人肝细胞和其他哺乳动物体细胞中得到了较多的应用[1]。

　　可回复性永生化技术得益于位点特异性Cre-LoxP介导的重组系统，该系统是Sternberg等在研究P1噬菌体作为稳定质粒的维持时发现的，由分子量为38 kDa的重组酶Cre及其特异性交叉位点LoxP组成(图2A)。在该系统中，Cre重组酶是一种可引起DNA片段重组的酶，其不仅具有催化活性，而且具有与限制酶相似的功能，可特异性识别永生化基因两侧的2个LoxP位点的DNA序列。LoxP位点由2个13 bp的反向重复序列和1个8 bp的间隔序列组成，其中反向重复序列是Cre重组酶的特异性结合位点，Cre酶能够根据LoxP位点的方向进行切除，所以8 bp的间隔序列决定了位点的方向性。虽然Cre-LoxP系统主要用于基因切除，但其也能诱导2个LoxP位点之间DNA的反转和易位，这取决于LoxP位点的方向和位置。图2B以产生时空控制的突变体小鼠为例，对Cre-LoxP系统进行应用阐释。1只小鼠通过靶向目标细胞的启动子表达产生Cre重组酶，同时另1只小鼠需要含有LoxP侧翼(floxed)DNA,最终表达Cre重组酶的小鼠可以识别切除另1只小鼠体内含LoxP侧翼的的等位基因Y,从而产生条件性基因敲除小鼠，且Cre重组酶的重组特异性和时间由其启动子或增强子控制。

　　3不同动物细胞永生化技术的研究现状

　　目前，使细胞永生化的普适方法是利用TERT基因或病毒(SV40 LT、EBV或HPV)基因转染的手段产生稳定细胞系。有不少学者在对主要经济动物(如猪、牛、羊、家禽和鸭等)及家兔和鼠的不同细胞的永生化研究上取得一定进展。

　　Sagong等为了利用猪单核细胞/巨噬细胞(Porcine alveolar macrophages,PAM)评估其生产猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的潜力，使用逆转录病毒载体包装人端粒酶逆转录酶(Human telomerase reverse tranase,hTERT)cDNA的方法，并将其稳定转染到原代PAM细胞中，结果显示，该细胞可无限增殖；进一步检测永生化PAM中的端粒酶活性，结果显示，hTERT基因持续表达，且PAM表面受体CD163的表达水平也未受影响。此细胞系的成功建立不仅可使PAM继续用于病毒的分离和生产，而且为病毒发病机制和免疫功能的研究提供可供选择的工具。此外，该试验还使用SV40 LT基因转染PAM,但结果显示，该细胞系表面的CD163受体蛋白没有表达，且细胞表型发生变化。以上结果表明，与转染SV40 LT基因的细胞相比，转染TERT基因的细胞更能代表原代细胞的表型。Xiao等为了研究细菌感染对牛免疫系统的影响，通过引入hTERT基因建立了一种牛骨髓来源的巨噬细胞系(Bovine bone marrow-derived macrophages,bBMMs),其细胞表面可表达与原代细胞相似的细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α)和表面抗原(CD11b和CD282)。该细胞系的建立为未来研究牛巨噬细胞与结核分枝杆菌之间的相互作用提供了细胞模型。

　　另外，Katwal等通过将SV40 LT基因、hTERT基因和HPV E6/E7基因分别转染早期传代的牛肠上皮细胞(Bovine intestinal epithelial cells,BIECs),成功建立了3种类型的永生化BIECs,这些永生化BIECs可作为研究上皮细胞生物学、宿主-微生物相互作用、免疫调节和发病机制的良好模型。Wang等[39]为了研究牦牛瘤胃上皮细胞(Yak rumen epithelial cell,YREC)的生理功能和营养吸收机制，使用慢病毒载体包装方法将hTERT和SV40T基因共转染到原代YREC中，结果显示，该细胞保留了原代细胞的形态和功能特征，且上皮细胞的标志蛋白——细胞角蛋白18呈阳性表达；同时，SV40 LT基因和hTERT基因在永生化细胞系中保持高表达。以上关于建立牛不同细胞系的研究表明，单独转染病毒基因或将hTERT与病毒基因共同转染均可使细胞系具备原代的表型特征，并且这些细胞系可作为研究牛肠道菌群平衡机制、瘤胃营养吸收机制和免疫调控机制的良好细胞模型。

　　除此之外，An等借助四环素诱导慢病毒表达系统将hTERT基因转染到大鼠骨髓间充质干细胞，构建了永生化大鼠骨髓间充质干细胞系(Human telomerase reverse transcriptase-immortalized bone marrow mesenchymal stromal cells,hTERT-BMSCs),其外源GAL基因的可控表达可用于治疗神经性疼痛。Chen等运用慢病毒介导的方式将SV40 LT基因转染原代兔黑色素细胞(Primary rabbit melanocytes,Pri RMC)建立了永生化细胞系。黑色素细胞(Melanocytes,MC)是一种在黑素小体内合成黑色素的特化细胞，其可作为研究与毛皮动物色素沉积机制相关的工具细胞。Puthumana等分别尝试使用病毒癌基因，SV40 LT基因和12型腺病毒早期区域1A(Adenovirus type 12 early region 1A,12S E1A)基因的重组杆状病毒转染斑节虾的淋巴细胞，虽然永生化基因在转染后的细胞上有所表达，细胞寿命有所增加，但仍无法建立永生化斑节虾淋巴细胞系，此结果表明，仅稳定表达永生化癌基因不足以使多数细胞永生化。发生永生化的核心是端粒长度稳定的问题，要保证端粒长度，就需要持续提高端粒酶活性，而端粒酶活性又受到hTERT基因的调控。因此，在对目标细胞进行永生化时必须把hTERT基因纳入考虑范围，而不能仅提高细胞的倍增次数。此外，Wang等[43]研究发现，使用hTERT基因无法恢复鸡前脂肪细胞端粒酶活性，通过单独转染鸡端粒酶逆转录酶(Chicken telomerase reverse transcriptase,chTERT)基因或与鸡端粒酶RNA(Chicken telomerase RNA,chTR)基因共同转染成功构建了2种永生化鸡前脂肪细胞系，这2种细胞系在体外均有较强的复制能力，端粒酶活性较高，没有复制衰老的迹象，保持了鸡原代前脂肪细胞的分化能力和形态特征，可作为体外模型来阐明鸡脂肪细胞分化和脂质代谢的机制，也可成为研究人类肥胖、胰岛素抵抗和相关疾病的潜在模型。

　　综合分析以上使用不同永生化方法的研究，发现哺乳动物和鸟类使用的细胞永生化方法存在明显差异，表明目前对大多数哺乳动物使用的永生化手段可能并不适用于家禽的某些细胞。有学者也曾使用hTERT基因转染鸡胚胎成纤维细胞，但是无法构建永生化鸡成纤维细胞系;而后有学者用试验证明，hTERT基因的异位表达可以使鸡羽毛角质形成细胞干细胞永生化。这种矛盾结果也说明，hTERT介导的鸡细胞永生化具有细胞类型特异性，可能是由于其端粒酶成分表达的物种差异所造成的。这些结果也可为其他禽类细胞类型的永生化提供参考。此外，Zhou等还研究了永生化鸭肠上皮细胞系(Immortalized duck intestinal epithelial cells,IDECs)的建立，为了探究白藜芦醇对H2O2诱导的IDECs抗氧化作用的分子机制，将SV40 LT基因通过慢病毒包装转染IDECs,并对其细胞表面的标记蛋白CK18进行检测，结果显示，成功建立了永生化IDECs。另外还有学者利用Cre/LoxP重组系统对细胞进行改造，实现了永生化，例如，Meng等先将可表达SV40 LT基因和潮霉素抗性基因的逆转录病毒载体导入猪肝细胞，之后通过Cre/LoxP位点特异性重组切除细胞中已经扩增的SV40 LT基因cDNA片段，最终建立了由逆转录病毒转导和位点特异性重组介导的永生化猪肝细胞系。

　　综上所述，各种动物不同细胞所使用的永生化方法不尽相同。其中，病毒基因虽然可诱导细胞发生永生化并在细胞中高度表达，从而延长细胞寿命和传代次数；但与原代细胞相比，永生化细胞存在染色体异常、细胞周期控制改变等缺点，并且SV40 LT基因等病毒基因长期存在于细胞中，具有不稳定性，容易导致细胞恶性转化，使其发生癌变。之前的研究证实，端粒缩短可能是细胞衰老的主要原因,而端粒长度的维持需要依靠端粒酶活性的诱导。在细胞中过表达hTERT基因不仅可以防止端粒缩短，还可启动端粒酶激活机制并延长细胞寿命，通常表达hTERT基因的细胞表现出正常细胞核型，也可维持正常的生理功能。多项研究已经通过过表达hTERT基因的方式获得了永生化细胞，包括马支气管上皮细胞系、牛II型肺泡上皮细胞系、山羊乳腺上皮细胞系和犬细支气管上皮细胞系等，应根据实际情况合理考虑并使用上述方法。

　　4总结与展望

　　细胞永生化技术在体外培养原代细胞开展试验研究方面愈发成熟，研究不同动物原代细胞有助于更快理解影响动物疾病、动物繁殖及其畜产品生产等相关的分子机制，从而可更深入地挖掘与其相关的关键基因和重要的上下游通路。常用的研究手段就是应用体外培养细胞模型，将其作为判断表观指标的重要依据。然而，正常原代细胞从体内分离后在体外生存时间都不会太长，给试验造成较大困难，所以试图寻找一种既适合不同动物细胞在体外长期增殖，又不会改变其自身生物学特性的方法，经过反复研究，细胞永生化技术的应用已取得一定进展，研究已经证实，癌细胞内的端粒长度调控其能否无限增殖，从癌细胞内提取出的TERT基因是使端粒长度保持稳定的关键因素。

　　本文结合普适的病毒基因转染细胞的方法，对比了不同细胞永生化方法的原理和应用，以期为不同类型的动物细胞建立永生化细胞系提供参考。然而，细胞永生化仍旧存在许多问题，例如，转染后细胞后期是否发生突变、是否依旧保持原代细胞的生物学特性、不同动物细胞使用同一种方法是否有效以及所转染的病毒基因是否会对细胞自身有影响等问题并不明确。因此，面对细胞永生化的一系列未解之谜，未来有必要开展特定的细胞培养等研究，阐明每一种细胞的分子机制并制定出使其永生化的最佳方案，为培养更多不同类型的永生化细胞奠定基础。