大鼠心肌细胞原代培养及鉴定

　　原代心肌细胞培养是体外研究心血管疾病相关机制的主要手段和基本技术。基础实验中，与细胞系相比，原代心肌细胞的形态及电生理方面更接近在体细胞，因此，培养原代心肌细胞的质量直接关系实验的进程及结果。

　　材料与方法

　　1.实验动物和主要试剂

　　1）新生24h内的SD大鼠10只，雌雄不限；

　　2）DMEM高糖培养基（CellMax）；

　　3）胎牛血清（CellMax）；

　　4）胰蛋白酶（CellMax）；

　　5）双抗（CellMax）；

　　6）D-Hanks；

　　7）5-溴脱氧尿嘧啶核苷

　　(5-Bromoo2'-deoxyuridine，5-Brdu)；

　　8）台盼蓝等。

　　2.主要实验仪器

　　1）高性能无菌超净台；

　　2）CO2培养箱；

　　3）倒置相差显微镜；

　　4）离心机；

　　5）恒温水浴锅；

　　6）磁力搅拌器、

　　7）200目钢网；

　　8）血细胞计数器、

　　9）解剖器械等。

　　注：

　　所有手术器械、离心管均高压灭菌。

　　玻璃器皿用强酸浸泡过夜，流水冲洗10次，去离子水冲洗3次，烘干后高压灭菌备用。

　　3.心肌细胞培养

　　新生24h内的SD大鼠10只，体积分数为75％的乙醇浸泡消毒2遍，每次约8s。无菌眼科剪沿胸骨正中人剪，尽量避免剪破其他脏器产生污染。用无菌镊子捏取心脏，迅速置于D-Hanks液中，仔细剥离大血管及多余组织，D-Hanks液反复认真冲洗至少3次，洗去残留的血细胞及其他杂质。

　　将心脏剪成约0.5mm×0.5mm×0.5mm的组织块放人锥形瓶，加入10mL质量分数为0.08％的胰蛋白酶封口，放入37℃水浴锅中消化，转子转速约90~100r·min-1。

　　第1次消化8min后静置弃上清。剩余组织进行多次消化，每次2min，收集每次消化后的上清液，直至全部组织消化完全。向上清液中加入体积约1/4~1/3的DMEM培养基（含15%的胎牛血清）以终止上清液中残余胰蛋白酶的消化作用，防止损伤细胞，保证成活率。全部上清液以1200r·min-1离心12min，所得沉淀用约20mL培养基轻轻吹散，用移液管缓慢吹打均匀，细胞悬液经200目孔径钢网过滤后移入培养瓶中进行差速贴壁（注意摇匀），55min后取细胞悬液以1000r·min-1离心10min，所得沉淀用培养基（pH=7.2）轻轻吹散。

　　根据台盼蓝染色结果及细胞计数结果调整细胞密度，以5×108L-1密度接种到培养板或培养瓶中，放入37℃的温箱中培养，24h后用D-Hanks液或磷酸盐缓冲液轻轻冲洗去未贴壁的细胞，可得到视野清晰、密度均匀的贴壁心肌细胞。然后换新鲜培养基继续培养，72h再次换液，根据细胞生长状态进行实验。

　　4.心肌细胞质量评价

　　1）心肌细胞观察

　　倒置显微镜观察细胞形态、生长状态、搏动频率、节律、强度，观察培养液色泽变化以判断心肌细胞生长是否良好。

　　2）台盼蓝拒染法计算细胞活力及细胞纯度的鉴定

　　心肌细胞悬液用等量体积分数为0.4%台盼蓝溶液混匀后用血细胞计数板分别计数活细胞和死细胞数。镜下死细胞染成蓝色，活细胞拒染而呈透亮状态。

　　细胞存活率=活细胞数/总细胞数（活细胞＋死细胞）×100%。

　　用免疫荧光法或通过细胞种板72h后计数搏动心肌细胞百分数测定心肌细胞纯度。

　　心肌细胞免疫荧光鉴定

　　（1）在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS（0.01M）浸洗3次，每次3min；

　　（2）用4%的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min；

　　（3）0.5%Triton X-100(PBS配制)室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；

　　（4）PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温（6%山羊血清，不用BSA，PBS配置）封闭30min；

　　（5）吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的ACTA1一抗（一抗浓度：1:20，一抗稀释液：PBS配置）并放入湿盒，4℃孵育过夜；

　　（6）37度复温45min，加荧光二抗（二抗换成羊抗兔IgG（H+L)/RBITC,二抗浓度：1:200，二抗稀释液：PBS配置）：PBS浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBS浸洗切片3次，每次3min；

　　注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。

　　（7）复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBS 5min×4次洗去多余的DAPI；

　　（8）用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后激光共聚焦拍照。

　　结果

　　1.心肌细胞形态观察

　　心肌组织消化后所有心肌细胞均为圆形，培养2~3h部分细胞开始贴壁，12h后可见梭形细胞，细胞逐渐增大，部分贴壁的细胞出现自发性搏动；24h细胞几乎全部贴壁，可见多角形细胞及较多细胞搏动；48h细胞形态为多角形或梭形，细胞伸出的伪足相互接触交织成网，逐渐形成细胞簇或细胞单层，铺满瓶底。72h后99%以上细胞自律搏动，搏动频率、节律、强度稳定，频率70~130次·min-1；大部分细胞相互连接，呈现同步搏动，同一培养瓶中细胞的搏动频率一致。

　　2.心肌细胞活力测定结果台盼蓝染色显示活细胞数>85%。

　　3.心肌细胞纯度测定通过细胞种板72 h后计数搏动心肌细胞百分数，所得心肌细胞纯度>95%。

　　4.心肌细胞免疫荧光鉴定结果

　　心肌细胞（细胞核）

　　心肌细胞（ACTA1抗体表达）

　　心肌细胞（合成图）

　　讨论

　　1.鼠龄选择

　　多数文献推荐1~3d大鼠，新生大鼠在出生后3d内心肌细胞尚未分化，心肌细胞培养时成活率高。

　　通过大量实验观察认为最好选择出生24h内新生大鼠。

　　2.无菌操作

　　防止污染是培养细胞成败的关键之一。

　　常见为细菌、支原体等污染，可导致提取后的细胞不贴壁、不生长、生长后状态不佳等。要严格执行实验室无菌操作规则且培养基中要加入终浓度为体积分数1%的双抗液。

　　3.组织消化

　　反复实验显示，0.5mm x 0.5mmx0.5mm体积的组织块更易快速消化且避免长时间消化给细胞带来损伤。

　　常用消化液有胰蛋白酶及胶原酶I、Ⅱ等。胰蛋白酶浓度推荐质量分数为0.060%-0.125%，胶原酶质量分数为0.06%-0.10%。

　　单独用质量分数为0.08%胰蛋白酶较实用。消化过程应在37℃下进行，用低速磁力搅拌器（80~100r·min-1）或手动摇晃及吹打使酶与组织充分混匀。

　　4.细胞洗涤

　　刚消化过的细胞本身附带消化酶，不利于细胞贴壁，因此，至少要洗涤细胞2~3次。将收集好的上清液加入含体积分数15%胎牛血清的培养基以终止消化，然后离心细胞（1200r·min-1，12 min）。

　　用培养基将离心后沉淀缓和吹散、混匀、过滤后再次离心（1000r·min-1，10 min），如此重复1~2次，可洗去黏附细胞的消化酶，有利于细胞贴壁。

　　5.细胞纯化

　　多选用差速贴壁分离法加化学抑制法。其原理是心脏组织消化后主要有2种细胞，即成纤维细胞和心肌细胞。

　　由于在培养瓶中大部分成纤维细胞能在短期内贴壁（50~120 min），而心肌细胞则需2~24h，因此，通过差速贴壁法能获得较纯的心肌细胞，约95%。差速贴壁分离细胞后，要在培养基中加入5-Brdu，终浓度为0.1mmol·L-1，目的是抑制成纤维细胞的生长。

　　6.细胞种植

　　细胞密度约5×108L-1时，72h后可见细胞伸展、接触，细胞间进行信息交流，形成同步搏动;（1~3）×108L-1时可观察单个细胞，可见到多种形态的细胞。

　　种植细胞24h后用磷酸盐缓冲液或D-Hanks液轻轻洗涤培养板或培养瓶，洗去未贴壁细胞得到可供实验的理想细胞。