SEC/MS 分析双特异性抗体
发布时间:2017-07-28 11:36 | 点击次数:
引言
双特异性抗体(bsAbs)作为一种新型单克隆抗体,正在生物治疗领域兴起。bsAbs 可识别两个不同的抗原表位,这种双重特异性使其比普通的单克隆抗体更具治疗效力,并拓展了其应用范围。双特异性抗体用于将 T 细胞重新导向肿瘤细胞、同时阻断两个不同的信号通路、针对不同疾病介质的双重锚定,并传递特定药物到目标位点。目前,有超过 50 个双特异性抗体产品已进入临床评估阶段。
对双特异性抗体表征是确保产品安全性及功效的前提。尺寸排阻色谱(SEC)串联质谱(MS)分析法正越来越多的用于确定包括双特异性抗体在内的生物大分子的精确分子量。不过,SEC/MS 要求使用不含有高浓度非挥发性盐类的流动相,以及不能使用填料颗粒会脱落的色谱柱,因为这会干扰 MS 信号响应。
本研究采用 TSKgel® UP-SW3000、粒径 2 μm 色谱柱以 SEC/MS 法对一个双特异性 T 细胞结合子(BiTE®)进行分析。这个双特异性 T 细胞结合子是由两个单链抗体(scFvs)通过一条非免疫原性 5-氨基酸链重组连接构成(图 1)。
图 1. 双特异性 T 细胞结合子(BiTE)的结构
HPLC 实验条件
色谱柱: TSKgel UP-SW3000,2 μm,4.6 mm ID × 30 cm
HPLC 仪器: Nexera® XR UHPLC 系统
MS 仪器: Q Exactive™ Plus
流动相: 20 mmol/L 醋酸铵,10 mmol/L 碳酸氢铵;pH 7.2
梯 度: 等度
流 量: 0.35 mL/min
检 测: UV@280nm
温 度: 30 ºC
进样量: 5.0 μL
样 品: BiTE,0.3 mg/mL(Creative Biolabs)
亲本单克隆抗体,0.5 mg/mL(Creative Biolabs)
电离模式: 电喷雾电离,正离子模式
MS 模式: 扫描,m/z 800-6000
*SEC/MS 分析由 Wistar Proteomics 和 Metabolomics Facility(Philadelphia, PA)进行
结果和讨论
将~55 kDa BiTE 和~150 kDa 亲本单克隆抗体注入到与 Q Exactive Plus 质谱仪相连接的 TSKgel UP-SW3000 色谱柱中进行测定。图 2 显示了 BiTE 的 (a) 总离子色谱图,(b) 质谱图和 (c) 解卷积质谱图。可在 m/z 54143 处看到主峰;在对应不同盐加合物的 m/z 54181、54219 和 54086 处看到相邻峰。
图 2. 通过 SEC/MS 分析确定 BiTE 的精确分子量为 54.1 kDa。
图 3 显示了其中一个亲本单克隆抗体的 (a) 总离子色谱图,(b) 质谱图和 (c) 解卷积质谱图。可在 m/z 149264 处看到主峰;在对应于不同糖式的 m/z 149426 和 149592 处看到相邻峰。另一个亲本单克隆抗体也得到了相似的结果(未显示数据)。
这些结果表明,使用与 SEC/MS 相兼容的流动相(20 mmol/L 醋酸铵、10 mmol/L 碳酸氢铵、pH 7.2),可以测定 BiTE 以及两个亲本单克隆抗体的精确分子量。
图 3. 通过 SEC/MS 分析确定亲本单克隆抗体的精确分子量为 149.3 kDa。
在分析前,运行一次空白进样来评估色谱柱的颗粒脱落情况。图 4a 显示了在一根新的 TSKgel UP-SW3000 色谱柱上运行空白进样后的总离子色谱图。MS 结果表明在样品进样前 TSKgel UP-SW3000 色谱柱没有发生填料颗粒脱落现象。此外,在每次样品进样前都运行一次空拍进样来监控样品残留。图 4b 显示了 BiTE 和亲本单克隆抗体之间一次空白进样的总离子色谱图。在运行中未观察到样品进样后有残留。实验结果表明 TSKgel UP-SW3000 色谱柱可以用于 MS 分析。
图 4. 从 MS 总离子色谱图中未观察到色谱柱颗粒脱落或样品残留。
结论
TSKgel UP-SW3000、2 μm SEC 色谱柱可以通过 SEC/MS 方法对双特异性抗体的精确分子量进行测定。在 TSKgel UP-SW3000 色谱柱上可以使用非变性条件下的 MS 兼容流动相。且未观察到 TSKgel UP-SW3000 色谱柱存在填料颗粒脱落或样品残留现象。