CHO细胞转染

CM=MEM+HT+FBS SM=MEM+FBS TM =MEM+HT

HT 是次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷混合剂，由于CHO-dhfr-细胞自身缺失二氢叶酸还原酶（dhfr），无法自身合成四氢叶酸，所以必须在添加了次黄嘌呤（hypoxanthine）、胸腺嘧啶（Thymidine）和甘氨酸的培养液中才能得以存活。

FBS 胎牛血清含有维持细胞生长的激素，基础培养基中没有的少量营养物；提供结合蛋白；解毒；贴壁细胞生长所需因子来源；缓冲系统；提供蛋白酶抑制剂。

1 初筛先用TM培养到6H（不含血清，因为转染所用是脂质体转染，其中阳离子脂质体其主要作用，将DNA包裹其中，血清中存在缓冲液系统，破坏转染），换用CM，因为是贴壁细胞，要用还有血清培养液；另外还有有HT才能正常生存。24H换CM到48H

（6-48h，一方面，转染主要有瞬时转染和稳定转染，在这个时间，瞬时转染基本消失，只剩下稳定转染；另一方面，转染成功细胞蛋白的表达时间），胰酶消化，用10倍胰酶的SM 中止——此时若DHFR基因已经成功转染，则可以在不含有HT的培养液中生存，即起一个筛选作用。同时可以认为与其连锁的目的基因也成功转染到宿主细胞。接下来再用G418进行筛选，NEO也是一个与目的基因连锁的基因，但是与DHFR结合在不同质粒上。如果成功转染，则可以在含有G418的培养液中生存。

2 复筛用MTX筛选。

而通过目的基因与dhfr基因共转染，不仅得到在不含上述添加剂的培养基上也能生长的细胞克隆，更为重要的是由于dhfr可被叶酸类似物MTX所抑制，在MTX浓度选择压力下，dhfr基因必须扩增到很多的拷贝数才能生存，从而得到抗MTX细胞系；又由于与dhfr基因共转染的目的基因倾向于同它一起整合到细胞染色体上的同一区域，所以编码外源重组蛋白的序列片段也随着dhfr基因的扩增而扩增，我们就得到了能大量表达外源蛋白的细胞克隆，这在基因工程抗体及各种基因工程蛋白的表达中是可行度很高的一种措施。

分析在初筛中，单独使用SM可以筛选出还有DHFR和目的基因的细胞；单独使用G418可以筛选出还有Neo和目的基因的细胞；而同时使用，则需要两种基因和目的基因都转染的细胞。