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普健生物(武汉)科技有限公司
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技术资料/正文
大肠杆菌表达步骤
2507 人阅读发布时间:2021-08-13 10:37
1. 获取目的基因
PCR或RT-PCR 法获得所需目的基因片段
2. 重组表达载体构建
(1) 将表达质粒用限制性内切酶进行双酶切,酶切产物进行琼脂糖电泳,胶回收kit回收载体片段
(2) PCR产物双酶切后进行胶回收
(3) T4连接酶连接载体及片段
3. 感受态细胞的制备(CaCl2法)
(1) 将大肠杆菌 DH5α接种至LB培养板,过夜培养
(2) 挑取单菌落于3-5ml LB液体培养基中,37℃震荡培养过夜
(3) 取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中,37℃摇床上250-300rpm震荡培养2-3h
(4) 吸取1.5ml培养好的菌液至离心管中,冰上冷却10min
(5) 4℃ 3000g 离心5min
(6) 弃上清,加入100ul预冷0.1M CaCl2,轻轻吹打混匀
(7) 细胞悬液添加(15%-20%甘油)后分装,于-80℃保存
4.转化
(1) 取200ul感受态细胞,解冻后立即置冰上
(2) 加入质粒DNA溶液(不超过50ng,体积不超过10ul)轻轻摇匀,冰上放置30min、42℃ 热击90s、冰上放置3min
(3) 管中加入1ml LB液体培养基(不含抗生素),混匀后37℃ 195rpm 培养30-60min
(4) 上述菌液摇匀后取100ul涂布于含抗生素的平板上,37℃过夜培养
5. 阳性重组子筛选及鉴定
(1) 含氨苄青霉素的LB平板上,加入20ul 20mg/ml X-gal和40ul 100mmol/L IPTG,涂布均匀
(2) 将所得含重组子的菌液吸至制备好的含X-gal的平板上,涂布均匀,将平板置于生化培养箱中正面放置30min,再倒置,37℃过夜培养
PCR或RT-PCR 法获得所需目的基因片段
2. 重组表达载体构建
(1) 将表达质粒用限制性内切酶进行双酶切,酶切产物进行琼脂糖电泳,胶回收kit回收载体片段
(2) PCR产物双酶切后进行胶回收
(3) T4连接酶连接载体及片段
3. 感受态细胞的制备(CaCl2法)
(1) 将大肠杆菌 DH5α接种至LB培养板,过夜培养
(2) 挑取单菌落于3-5ml LB液体培养基中,37℃震荡培养过夜
(3) 取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中,37℃摇床上250-300rpm震荡培养2-3h
(4) 吸取1.5ml培养好的菌液至离心管中,冰上冷却10min
(5) 4℃ 3000g 离心5min
(6) 弃上清,加入100ul预冷0.1M CaCl2,轻轻吹打混匀
(7) 细胞悬液添加(15%-20%甘油)后分装,于-80℃保存
4.转化
(1) 取200ul感受态细胞,解冻后立即置冰上
(2) 加入质粒DNA溶液(不超过50ng,体积不超过10ul)轻轻摇匀,冰上放置30min、42℃ 热击90s、冰上放置3min
(3) 管中加入1ml LB液体培养基(不含抗生素),混匀后37℃ 195rpm 培养30-60min
(4) 上述菌液摇匀后取100ul涂布于含抗生素的平板上,37℃过夜培养
5. 阳性重组子筛选及鉴定
(1) 含氨苄青霉素的LB平板上,加入20ul 20mg/ml X-gal和40ul 100mmol/L IPTG,涂布均匀
(2) 将所得含重组子的菌液吸至制备好的含X-gal的平板上,涂布均匀,将平板置于生化培养箱中正面放置30min,再倒置,37℃过夜培养