ELISA 实验步骤：

1.包被抗原：稀释液pH 9.6 碳酸盐缓冲液，多肽浓度2ug/ml，0.1ml/孔，4oC过夜，洗净。

2.1%BSA (pH 9.6 碳酸盐缓冲液) 封闭，0.1ml/孔，37oC1h，洗净。

3.稀释抗血清(可稀释不同浓度) 0.1ml/孔，37oC 30分钟，洗净。

4.稀释辣根过氧化物每标记的二抗0.1ml/孔，37oC 40分钟，洗净。

5.显色：TMB显色

A液：四甲基联苯胺10mg 溶于DMF1ml中，再用pH5.0柠檬酸缓冲液稀释100倍.

B液：5ul双氧水加蒸馏水12.5ml 。

终止液：2N硫酸

A液、B液各一滴，比光显色10分钟，终止液一滴。

6.450nm 波长测OD值

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样本收集：

血清样本用干燥管（红色）或者促凝管（黄色）收集

血浆用抗凝管，一般有EDTA抗凝（紫色）、枸橼酸钠抗凝（黑色或者蓝色）

血浆样本最好是不要用肝素（绿色）抗凝的试管收集

样本处理：

1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.

7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

样本保存：

2-8℃冰箱最多2周

-20到-50℃的冰箱可以放3-6个月

-50℃一下的冰箱，可以放一年

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