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技术资料/正文
细胞荧光显微镜故障排除和最佳做法(二)
231 人阅读发布时间：2024-04-17 08:42
荧光显微镜故障处理技巧
应尽可能防止光漂白，因为这会对样本造成损害。可以通过向样本添加抗褪色试剂、使用特殊介质，减少样本暴露于光下的时间来实现。减少这种曝光包括减少总体光强度或在不观察或拍摄样本时，使用显微镜照明器中的滤光片滑块或快门阻挡激发光的方法。
如果在制片前彻底清洗染色后的样本以去除过多的荧光物质，也可以限制样本的自发荧光。
虽然透明胶片可能因其能提供增强的对比度和色彩饱和度而更受青睐，但日光平衡透明胶片可能有助于提供样本颜色、分辨率或对比度的最佳呈现。
建议和预防措施
表一.不断增加的媒体注意事项
1.理想情况下所有显微镜观察都应在黑暗房间内进行,对荧光显微镜来说这一点尤其重要。因为人眼很难快速适应黑暗,而荧光信号比较弱时,眼睛就很难在黑暗中辨别细微的荧光变化。
2当选择适合显微镜的组件时,建议选择一款配有玻璃或石英透镜的目标物镜。这种镜头材料在近紫外光区域具高透明度。
3.使用最低放大倍数的投影镜将有助于限制图像的总放大倍数。
4.对比反射式荧光光学成像,总体来说采用透射式荧光时成像效果较差。不过,如果采用透射式,使用暗场造片机可以有助于改善成像质量。
注意:选择合适的光圈滤膜也有助于优化样品中荧光素的对比度。关键是这些滤膜需要匹配样品的荧光激发和二级荧光特性。
最佳的光源选择是氙气灯和汞蒸气灯，或者可以精确调节到特定波长的激光灯。
对任何类型的荧光显微镜来说,在照明源和荧光滤镜之间加入一个隔热滤镜都非常重要。这能有效限制可能造成的过热损害。
当灯具开始闪烁,或者样品的部分区域明暗不均时,很可能就是时候更换光源了。
图3.U2OS细胞经过1小时的Calcein AM孵育后固定于含2%甲醛的96孔黑色板内。去除全部培养基后加入防褪色染料。使用荧光显微镜与相同的曝光设置对0秒和30秒的FITC信号强度进行比较。
应尽可能防止光漂白，因为这会对样本造成损害。可以通过向样本添加抗褪色试剂、使用特殊介质，减少样本暴露于光下的时间来实现。减少这种曝光包括减少总体光强度或在不观察或拍摄样本时，使用显微镜照明器中的滤光片滑块或快门阻挡激发光的方法。
如果在制片前彻底清洗染色后的样本以去除过多的荧光物质，也可以限制样本的自发荧光。
虽然透明胶片可能因其能提供增强的对比度和色彩饱和度而更受青睐，但日光平衡透明胶片可能有助于提供样本颜色、分辨率或对比度的最佳呈现。
建议和预防措施
表一.不断增加的媒体注意事项
| 安装介质应做的 | 安装介质不应做的 |
| 使RI尽可能接近玻璃的RI，并且无色透明 | 使污渍扩散或褪色 |
| 能够完全渗透并填充组织间隙 | 慢慢变粘或变硬 |
| 抗污染，微生物和真菌生长 | 收缩内盖边缘，并在硬化后滑动 |
| 防止物理损坏和化学活动，如氧化或pH值变化 | 不与污渍和反应产物发生反应、浸出或引起褪色 |
| 与脱水剂或清洗剂完全混溶，混合均匀 | 使试样结晶、开裂、收缩或变形 |
| 随时间保持稳定 | 对组织成分有不良影响 |
1.理想情况下所有显微镜观察都应在黑暗房间内进行,对荧光显微镜来说这一点尤其重要。因为人眼很难快速适应黑暗,而荧光信号比较弱时,眼睛就很难在黑暗中辨别细微的荧光变化。
2当选择适合显微镜的组件时,建议选择一款配有玻璃或石英透镜的目标物镜。这种镜头材料在近紫外光区域具高透明度。
3.使用最低放大倍数的投影镜将有助于限制图像的总放大倍数。
4.对比反射式荧光光学成像,总体来说采用透射式荧光时成像效果较差。不过,如果采用透射式,使用暗场造片机可以有助于改善成像质量。
注意:选择合适的光圈滤膜也有助于优化样品中荧光素的对比度。关键是这些滤膜需要匹配样品的荧光激发和二级荧光特性。
最佳的光源选择是氙气灯和汞蒸气灯，或者可以精确调节到特定波长的激光灯。
对任何类型的荧光显微镜来说,在照明源和荧光滤镜之间加入一个隔热滤镜都非常重要。这能有效限制可能造成的过热损害。
当灯具开始闪烁,或者样品的部分区域明暗不均时,很可能就是时候更换光源了。
图3.U2OS细胞经过1小时的Calcein AM孵育后固定于含2%甲醛的96孔黑色板内。去除全部培养基后加入防褪色染料。使用荧光显微镜与相同的曝光设置对0秒和30秒的FITC信号强度进行比较。
| 货号 | 名称 | 规格 |
| 20001 | FluoroQuest抗淬灭试剂盒I 适合载玻片成像 | 1kit |
| 20003 | FluoroQuest抗淬灭试剂盒II 适合微孔板成像 | 1kit |
| 20004 | FluoroQuest封片剂（含有DAPI） | 50 ml |
| 20005 | FluoroQuest 防褪色固定介质（含DAPI） | 20 ml |
| 20006 | 荧光信号增强液 FluoroQuest | 5 ml |
| 20007 | FluoroQuest抗淬灭封片剂 | 5 ml |
| 20008 | FluoroQuest PLUS 抗淬灭封片剂 | 5ml |
| 44890 | FluoroQuest TSA/PSA 抗淬灭封固剂 | 5 ml |