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技术资料/正文
百萤课堂之一种新的活细胞钙通量荧光钙指示剂
704 人阅读发布时间：2024-02-27 09:02
荧光钙Ca2+指示剂（例如Indo-1,Fura-2,Fluo-3和Fluo-4）通常用于监测包括HTS、荧光成像和流式细胞术在内的各种应用中的Ca2+应答。然而，这些染料需要有机阴离子转运蛋白抑制剂（例如丙磺舒）的存在，以防止许多细胞类型（例如CHO和Hela）的指示剂泄露。有机阴离子转运蛋白抑制剂对细胞有毒性，其中一些已知是某些GPCR（例如趋化因子受体）的抑制剂。由于这些原因，这些染料的用途是有限的。因此，我们开发了一种超亮无丙磺舒荧光钙指示剂------CalbryteTM520AM.CalbryteTM520AM具有细胞渗透性和非荧光性。一旦进入细胞，CalbryteTM520AM通过脂酶被加工成CalbryteTM520。当与Ca2+结合时，CalbryteTM520产生非常明亮的荧光信号，具有非常高的信号与背景（S/B比率）。
CalbryteTM520AM荧光钙指示剂原理
方法：
结果：
1.使用丙磺舒诱导CHO-K1细胞钙通量的研究
ATP诱导CHO-K1细胞内源性P2Y应答。将含有2.5mM丙磺舒的PluronicF127缓冲液中的CalbryteTM520AM或Fluo-4AM与细胞在37℃温育45分钟。10µMATP（最终结果）图像由荧光显微镜使用FITC频道拍摄。
ATP诱导CHO-K1细胞内源性P2Y应答。将含有2.5mM丙磺舒的PluronicF127缓冲液中的CalbryteTM520AM或Fluo-4AM与细胞在37℃温育45分钟。10µMATP（最终结果）图像由荧光显微镜使用FITC频道拍摄。
3.RANTE诱导CHO-CCR5细胞钙通量的研究
将表达趋化因子受体5(CCR5)的CHO细胞与CalbryteTM520AM或Fluo-4AM在不同的染料上样缓冲液中在37℃下孵育1小时，
CalbryteTM520AM荧光钙指示剂原理
方法：
- 将100µL/孔细胞接种于37℃培养箱中的96孔黑壁/透明底Costar板中过夜；
- 将细胞与含有钙指示剂(5µg/mL)的100µL染料上样缓冲液在37℃温育30分钟至1小时；
- 然后在有或没有感兴趣的化合物的情况下在 37°C 下再孵育 15 分钟；
- 去除染料上样缓冲液并用200µLHHBS（洗涤条件）或留在孔中（无洗涤条件）；
- 加入50µL/孔的钙通量刺激剂，并通过荧光显微镜 (Keyence)、FlexStation (Molecular Devices) 或流式细胞仪 (NovCell 3000) 监测钙通量。
结果：
1.使用丙磺舒诱导CHO-K1细胞钙通量的研究
ATP诱导CHO-K1细胞内源性P2Y应答。将含有2.5mM丙磺舒的PluronicF127缓冲液中的CalbryteTM520AM或Fluo-4AM与细胞在37℃温育45分钟。10µMATP（最终结果）图像由荧光显微镜使用FITC频道拍摄。
- 不使用丙磺舒诱导CHO-K1细胞钙通量的研究
ATP诱导CHO-K1细胞内源性P2Y应答。将含有2.5mM丙磺舒的PluronicF127缓冲液中的CalbryteTM520AM或Fluo-4AM与细胞在37℃温育45分钟。10µMATP（最终结果）图像由荧光显微镜使用FITC频道拍摄。
3.RANTE诱导CHO-CCR5细胞钙通量的研究
将表达趋化因子受体5(CCR5)的CHO细胞与CalbryteTM520AM或Fluo-4AM在不同的染料上样缓冲液中在37℃下孵育1小时，
- HHBS，含有含有 Pluronic F127，不含丙磺舒。
- HHBS 与 Pluronic F127 和 2.5 mM 丙磺舒。
- HHBS，含有 Pluronic F127 Plus 缓冲液，不含丙磺舒。通过 FlexStation 添加 100 nM RANTES（最终浓度）之前和之后监测细胞内 Ca2+100秒。