应用速递 | 应用FIDA进行溶液内动力学分析

结合动力学检测是开发和表征蛋白类药物的一个组成部分。目前结合动力学的常用技术包括基于BLI和SPR的表面固定测量技术。表面固定测量技术具有诸多难点，比如表面化学成分需要优化、非特异结合、需要纯化样本等。

在这里，我们提出了一种新的溶液内测量方法（FIDA），仅使用纳升到微升的样品测量结合动力学。该方法可以应用于任何缓冲液条件或基质环境中的蛋白相互作用。它易于设置，测量分析可全自动化完成。

FIDA，(Flow Induced Dispersion Analysis) 即流体诱导分散分析，基于毛细管中层流运动的分析方法，当样品通过毛细管时，由于毛细管中心和毛细管壁之间速度不同，毛细管中心速度快，毛细管边缘速度慢，样品流动呈抛物线剖面。不同的抛物线剖面（图1.A）决定了信号曲线的形状（图1.B），结合斯托克爱因斯坦方程和泰勒分散公式，以此实现对分子粒径（size，流体力学半径R_h）“第一性原理（first principle）”测量。FIDA的流体动力学半径测量广泛适用于生物分子稳定性、构象变化、相互作用等方面的研究。

图1 FIDA基本原理。A. 样品在毛细管中分散分布示意，横截面轮廓形状取决于带有荧光的分子大小或其与配体形成的复合物大小；B. 信号峰：样品流经检测器时产生；C-D. 扩散系数D和流体力学半径R_h计算，拟合可得到分子互作亲和力K_D值等。

除了结合动力学（K_on和K_off）之外，FIDA还可测量平衡结合常数（K_D）和流体动力学半径（R_h）。使用FIDA方法获得的数据与SPR非常吻合。

图 2 亲和体与利妥昔单抗相互作用示意图；亲和体作荧光标记。

FIDA溶液动力学检测

图3：FIDA溶液内动力学的检测流程

• 该指示剂(indicator)与微流控毛细管内的分析物(analyte)混合。指示剂/分析物混合物在压力驱动下流过毛细管，当通过探测器时记录荧光信号。

• 检测时间随使用压力（图3a）改变。

• 指示剂的信号拟合曲线随浓度、动力学常数和 K_D （图3b） 而变化。

• Fidabio数据分析软件模块拟合数据以确定动力学速率常数（图3c）。

FIDA和SPR蛋白-蛋白互作动力学数据比较

• K_D(FIDA) 测量使用FIDA仪器480nm荧光检测模块，采用pre-mix分析模式。

• K_on(FIDA)与K_off(FIDA)测量采用cap-mix模式。

• SPR数据采用BiacoreX100平台测量。

• 各平台测试，均使用PBS缓冲液。

FIDA溶液内动力学检测亮点

1. 溶液中检测，nL-uL样品，无需表面固定

2. 快速分析方法开发----即使复杂样品基质

3. 实时R_h（结合化学计量比）测量，荧光强度和每个数据点质控参数

4. 动力学：5-10s到数小时

5. 快速K_off测定----无需表面再生