文献分享 | P4SPR在临床科研中的应用

接受天冬酰胺酶治疗的急性淋巴细胞白血病患者的反应监测：等离子体传感检测在临床样品分析中的成功与挑战

急性淋巴细胞白血病(ALL)是一种源于骨髓的未成熟白细胞发生癌变的疾病，除了阻止其他血细胞的正常功能外，还会在血流中引起增殖并随后扩散到器官。大肠杆菌L -天冬酰胺酶(EcAII)作为一种生物治疗剂，被证明对ALL有效的主要治疗药物之一。接受这种治疗的挑战，患者可能会通过产生抗体来中和EcAII，导致生化治疗剂沉默失活，从而降低治疗效果。

图1  SPR检测流程开发示意图

目前在用L-天冬酰胺酶治疗的白血病患者中量化抗天冬酰胺酶抗体的方法是酶联免疫吸附测定法（ELISA）。能否开发一种新的检测方法，样本消耗更少、样本制备更简单、时效性也更好的方法，以整合到白血病治疗与用药监测中呢？研究者在本文中，利用Affinite Instruments公司的P4SPR分子互作平台开发了一种抗天冬酰胺酶抗体检测方法。

研究中涵盖了生物芯片的设计、配体的选型、检测灵敏度与线性范围的模型测试，以及实际临床血液样本的无稀释检测，与ELISA方法的对比与优化等。

图2 (A)抗天冬酰胺酶生物芯片 (B)不同的L -天冬酰胺酶受体结构 (C) L -天冬酰胺酶抗体直接检测与间接检测示意

如图2所示，为了降低血清样本与芯片的非特异结合，作者开发了一种表面多肽修饰的传感芯片；同时为了考察配体固定时随机固定与定向固定的区别，除了天然的EcAII，作者还表达了3种His-tag标签的EcAII：N21-EcAII，N末端20个氨基酸；N26-EcAII，N末端25个氨基酸；C8-EcAII，C末端8个氨基酸。

通过对比实验，相比于其他3种样本，研究者发现固定N26-EcAII有显著的检测重复性。

图3 N26-EcAII受体检测未稀释人血清中兔抗天冬酰胺酶抗体SPR校正曲线(A)与SPR传感图

研究者选用N26-EcAII作为固定配体，通过在人血清中加入兔抗天冬酰胺酶抗体作为测试模型，结合校准曲线，确定检测限为0.5nM; 如图3所示，当分析物浓度在100nM-1uM之间时，有良好的检测动态范围。

检测方法确立后，研究者作了临床血液样本的分析测试。

图4 直接法SPR与ELISA分析结果比较

可能是样品本身的异质性(不透明度、色素等)及检测方法亟待完善，如图4所示，初始直接法获得的SPR结果与ELISA结果也有显著差异；8个样本中，只有3个样本的SPR结果与ELISA检测有相关性。

为了克服样本异质性的影响，同时不影响分析灵敏度和样品制备环节，在此基础上，使用与ELISA分析相同的二抗，研究者开发了二次检测步骤。

图5 间接法SPR与ELISA分析结果比较

在改良后的SPR实验中，如图5所示，8个样本中，7个样本检测结果SPR法与ELISA法一致。研究者推测，样本7检测结果不一致，可能与L-天冬酰胺酶固定时的立体结构方向有关，与该患者免疫表达抗体的结合位点没有有效暴露而导致。

在本文中，研究者通过多角度的摸索优化，在SPR平台上，首次实现了对临床血样中天冬酰胺酶抗体的无稀释检测。虽然在针对临床样本检测中还存在样本异质性、检测灵敏度等挑战，但同时该文为疾病的预后监测研究提供了一种新思路。

在该文献中，研究者使用的是Affinite Instruments公司的个人型分子互作仪P4SPR。P4SPR分子互作仪，四通道设计，独特的3+1流路模式，一次试验即可获得三次重复实验数据，参照通道可实时扣除背景信号；与传统的互作分析方法比较，个人型分子互作仪P4SPR可提供快速、实时、无标记的互作检测分析；适合于蛋白、多肽、核酸、多糖、小分子等多种样品分析；同时，P4SPR也是一款普通实验室即可买得起用得起的分子互作检测利器。

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