CERO|动态3D培养MSCs-GM促进软骨形成

在软骨组织工程和再生医学领域中，有许多临床前研究表明干细胞能有效地使损伤软骨组织恢复功能；另外，逾200例临床试验采用干细胞来处理软骨组织损伤，并研究其应用于病患时的安全性、有效性、长期可行性。其中，有些结果表明治疗有效，有些则反之。

MSCs（间充质干细胞）常被选为细胞材料。这是因为它具有多潜能性、安全性，且较少引发免疫反应。有数据显示，要在临床中对患者有效治疗，需要大量的MSCs（1千万-1亿个细胞）。一些临床研究采用单层2D细胞堆叠培养以获取足量的细胞，这种方式需要较长的体外培养周期。很多报告显示长期体外培养会导致干细胞丧失干性，包括有丝分裂能力、集落形成单位效率。另外，还有报告显示MSCs随着培养时间增加会倾向于失去分化为软骨组织的潜能。这解释了上述临床试验失败的可能原因。

该试验在GM（明胶微球）表面接种BMSCs（骨髓间充质干细胞）后，放入CERO中进行3D培养，以期提高细胞产量；另外，采取了动态培养的模式，以期通过机械刺激增加软骨分化形成。

该试验使用CERO 3D悬浮培养仪，通过精确的旋转参数设置，来实现自动化、周期性、间歇性的3D动态悬浮培养。通过CERO的50ml培养管内部的鳍片结构，轻松的实现搅动悬浮，并且极大程度的降低了剪切力，较少细胞损伤。

另外进行了静态3D培养，也在组织培养平板上进行了培养，来进行对比。下面介绍其实验过程和结果。

制备GM

采用油包水的方法制备GM，A为干条件下的图像，B为湿条件下的图像。D展示了GM的球状形态和光滑表面。

接种和培养BMSCs

在CERO中通过精确的设置参数，实现自动化的间歇式搅拌，使用FD培养基将BMSCs接种到GM上，获得BMSCs-GM。

D为第7天的BMSCs-GM的CLSM图像，用Hoechst染色细胞核，鬼笔环肽-TRITC染色细胞肌动蛋白。A、B、D比例尺均为100μm。

“2D”和“3D”培养的对比

A中可以看出随着培养时间增加，3D培养（BMSCs-GM）的细胞产量明显高于2D培养（GMSCs-TCP，组织培养板）。

另外，C中可以看出3D、2D培养都可以分化出三种主要细胞谱系：骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞。比例尺为100μm。

动态、静态环境下的细胞和ECM

本图显示了不同培养基，动态/静态的差异。简写中，前两字母的CM代表CIM培养基（软骨诱导培养基），FD代表FD培养基（F12：DMEM=1：1）；末尾字母S代表静态（static），D代表动态（dynamic）。

CERO动态3D培养条件下，细胞和ECM产量明显高于静态培养。并且，BMSCs在微球体表面积累了大量ECM蛋白，表明细胞-细胞间联系、细胞-微球体间联系均有产生。

E中比例尺100μm；F中比例尺40μm。

软骨分化对比

免疫组织化学染色图像显示出了II型胶原蛋白的表达，动态培养条件高于静态培养条件。蛋白多糖亦然。

结语

CERO的3D动态悬浮培养明显地提升了细胞、ECM产量，且有利于BMSCs的软骨分化。

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文献：

Sulaiman, S.; Chowdhury, S.R.; Fauzi, M.B.; Rani, R.A.; Yahaya, N.H.M.; Tabata, Y.; Hiraoka, Y.; Binti Haji Idrus, R.; Min Hwei, N. 3D Culture of MSCs on a Gelatin Microsphere in a Dynamic Culture System Enhances Chondrogenesis. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 2688. https://doi.org/10.3390/ijms21082688