N家干货 | 聊聊G-CSF及其活性细胞株

1.靶点介绍

造血细胞集落刺激因子（Colony-Stimulating Factor，CSF）的研究进展迅速，目前研究人员已经发现了多种CSF，每种CSF有着不同的来源。

表1. 集落刺激因子的分类

G-CSF是由多种细胞产生的一种蛋白质，包括成熟的T细胞、单核细胞、成熟的巨噬细胞、内皮细胞和成熟的肿瘤细胞。G-CSF最早是在20世纪80年代中期，由Memorial Sloan-Kettering肿瘤中心的研究团队发现和提纯的。

图1. CSFs及其家族示意图

（https://www.acrobiosystems.cn/L207-CSFs.html）

图2. 晶体学研究显示的G-CSFRs结构图（doi：10.1002/cam4.239）

G-GSF受体单体（绿色和蓝色）由细胞外Ig样结构域（Ig）、细胞因子受体同源结构域（CRH）和三个纤连蛋白III型样结构域组成，随后是跨膜区和细胞质结构域。在与G-CSF（红色）结合后，受体通过Ig样结构域聚合形成活性信号复合物。

2.靶点功能

G-CSF的主要功能是促进骨髓中粒细胞的生成、分化、成熟和释放，特别是中性粒细胞（一种重要的白细胞）。G-CSF通过结合目标细胞表面的G-CSFR（CSF3R）来发挥作用，这些受体分布在骨髓干细胞、粒细胞和成熟的中性粒细胞上。一旦结合，G-CSF将激活一系列信号转导途径，促进粒细胞的增殖和分化，并加速它们从骨髓向外周血的释放。

在免疫系统中，粒细胞是一种重要的白细胞，负责对抗感染和清除异物。因此，G-CSF在维持免疫系统功能方面起着关键作用。

在临床上，G-CSF常用于治疗因化疗而导致的粒细胞减少症，通过促进粒细胞的产生和释放来提高患者的免疫功能。此外，G-CSF也被用于促进造血干细胞移植后的骨髓功能恢复。

3.作用机制

图3. MataCoreTM通路分析给出的假定的信号通路

（doi：10.1002/cam4.239）

图3展示了MataCoreTM通路分析生成G-CSF或GM-CSF的假定信号通路，其中，绿色箭头表示激活的信号通路，而红色箭头表示抑制的通路。

4.疾病相关

肿瘤的发生、生长和转移与肿瘤细胞所处的内外微环境密切相关。这个微环境包括肿瘤细胞自身（如细胞核和细胞质）的内在环境，以及周围的免疫细胞和免疫调节因子所形成的外部环境。肿瘤微环境不仅涉及到肿瘤所在组织的结构、功能和代谢，而且也涉及到肿瘤细胞周围的复杂相互作用。

肿瘤细胞表面的G-CSFR通过与其配体G-CSF相结合，可以激活多个细胞内信号通路，促进肿瘤细胞的增殖、侵袭与转移，并且还可以促进肿瘤血管的形成。使用抗体中和G-CSFR可降低G-CSF的激活作用，从而阻止肿瘤细胞的增殖和转移。

图4. G-CSF/G-CSFR在实体肿瘤免疫中的作用

（doi：10.11877/j.issn.1672-1535.2018.16.06.01）

5.药物研发

中性粒细胞减少是肿瘤患者在放化疗后常见的并发症，而G-CSF已成为预防和治疗这一问题的主要药物之一。它能够有效地缩短骨髓抑制期，并降低中性粒细胞减少的严重程度。目前，越来越多的国家和公司针对CSF-3R研发出针对性药物。

图5. 全世界范围内基于药物不同研究项目统计的研发状态

（来源：药物情报库）

图6. 排名前十的机构及其药物所属研发阶段的分布（来源：药物情报库）

图6. 药物研发机构所在地区的前五名（来源：药物情报库）

图7. CSF-3R相关的排名前十的适应症，及其药物所属研发阶段的分布（来源：药物情报库）

6.G-CSFR相关活性检测细胞株

（1）背景介绍

NovoBio自主构建的HEK293-G-CSFR-Luc报告基因细胞株的细胞表面表达G-CSFR(CSF3R)，下游具有报告基因RE-Luciferase。当G-CSF蛋白与细胞表面的G-CSFR(CSF3R)结合后，通过细胞内的信号转导诱导下游反应元件激活从而促进Luciferase信号的表达，该信号值高低和G-CSF蛋白活性或浓度成正比，形成剂量依赖型曲线。

（2）作用机制

图8. 报告基因法检测G-CSF作用机制图

（3）数据展示

①单克隆活性验证：

G-CSF蛋白刺激HEK293-G-CSFR-Luc细胞释放Luminescence信号。HEK293-G-CSFR-Luc对G-CSF有很好的响应，该信号值高低和G-CSF蛋白活性或浓度成正比，形成剂量依赖型曲线。

图9. HEK293-G-CSFR-Luc检测G-CSF活性结果图

②qPCR检测靶标数据：

用qPCR检测手段检测HEK293-G-CSFR-Luc表面的G-CSFR的表达情况，用空白细胞HEK293作为阴参对照。其结果表面：两对qPCR引物均不能在空白细胞HEK293细胞中检测到有效扩增， 但是可以在HEK293-G-CSFR-Luc细胞中均得到有效扩增。

表1. qPCR检测靶标数据表

③专属性研究：

用药物GM-CSF蛋白和Nomal Human IgG Control蛋白作为阴参对比，检验HEK293-G- CSFR-Luc细胞株的活性专属性，细胞株对G-CSF有明显的浓度依赖响应信号，对GM-CSF和Nomal Human IgG Control没有响应。细胞株具有较好专属性。

图10. HEK293-G-CSFR-Luc专属性结果

④准确度和精密度研究：

使用G-CSF蛋白验证HEK293-G-CSFR-Luc的准确度和精密度。在50%、100%和150%的效价水平中，数据之间的相对标准偏差（RSD）<20%（见表2）。 

以效价理论值作为横坐标，效价实际值作为纵坐标做直线回归方程，直线回归方程为y=1.0324x-0.0698，R²=0.9984（见图4）。

 

表2.不同效价的准确度和精密度验证结果

图11. HEK293-G-CSFR-Luc 效价线性验证

⑤代次稳定性研究：

用G-CSF蛋白考察不同代次的HEK293-G-CSFR-Luc细胞株的稳定性，分别考察了P5、P10、 P15、P20不同代次之间该细胞株的细胞生物学活性实验的稳定性，可以看出4个代次的细胞生物学 曲线相似，窗口值接近，EC50值RSD＜20%，该细胞稳定性较好。

图12.HEK293-G-CSFR-Luc 细胞株代次稳定性研究结果图

（4）优势特点

✅方法稳定、变动小；

✅实验窗口大、响应值高；

✅利用转基因构建的细胞可稳定传代；

✅该细胞株可以作为G-CSF药物活性检测细胞株；

✅适合放行、长期稳定性检测，方便方法验证。

📚 充实您的研究方法学，推动医学科学的进步！💪