N家干货 | 聊聊FSHR及其活性检测细胞株

1.靶点介绍

卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH)是垂体分泌的一种糖蛋白激素。FSH可以刺激雌性卵巢内卵泡的发育，促进雄性睾丸内精子的发生。它还能够刺激类固醇生成，促进卵巢颗粒细胞增生，是下丘脑-垂体-性腺轴中的主要激素之一。

卵泡刺激素受体(follicle-stimulating hormone receptor, FSHR)是一种跨膜糖蛋白，属于G蛋白偶联受体超家族中的糖蛋白亚家族成员。其分子结构包括胞外区、跨膜域和胞内氨基酸序列信号激活区3 个部分。其跨膜域是由7个插入细胞膜的亲脂性螺旋构成的跨膜蛋白复合体，而胞外区则依配体的结合类型而形成不同的大小。

长久以来，FSHR被认为仅特异性表达在性腺组织中。但近年的临床疾病相关研究报道了大量非性腺组织的FSHR表达，包括非性腺生殖系统组织，如子宫内膜、子宫肌层和输卵管、胎盘、脐静脉内皮细胞，其他器官组织如骨骼、脂肪、肝脏，以及恶性肿瘤血管和肿瘤转移灶等，表明FSHR可能存在一些全新的生物学功能。

2.信号通路简介

图1.FSH-FSHR信号通路

（Molecular Mechanisms of Action of FSH）

（1）G蛋白介导的信号

FSHR经典的胞内信号转导方式为Gαs /环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）/蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）信号通路，该通路激活cAMP反应元件结合蛋白（cAMP response element-binding protein， CREB）调控基因转录。cAMP的主要作用可以分为依赖PKA的信号通路激活和非PKA依赖的信号通路激活。

（2）FSHR相关协同分子参与的信号传递

除了G蛋白外，FSHR的七跨膜域和胞内区还能够与许多接头蛋白、分子或其他受体发生相互作用，影响特定信号通路激活和生物学功能。

✦协同蛋白

β-arrestins、APPL1、GIPC和14-3-3tau：β-arrestins是除了G蛋白以外与GPCR信号关系最密切的一类支架蛋白，它能够调节GPCR的脱敏、内吞和循环，并参与GPCR的信号调控，其中最经典的信号调控功能是调控ERK/MAPK信号的激活；APPL1接头蛋白和β-arrestins一样，也在很多细胞中起着重要的信号调节和受体胞内转运的作用，包括卵巢和睾丸细胞；GAIP互作蛋白C端（GAIP-interacting protein C terminus， GIPC）可以促进FSHR内吞并结合到早期胞内体，维持FSHR激活的MAPK信号，介导FSHR信号在胞内的进一步传递；14-3-3tau接头蛋白可以结合FSHR七跨膜域的第二个胞内环路区域，同时也是FSHR与G蛋白的互作位点，并介导Akt信号通路的激活。

✦钙离子转运

在睾丸支持细胞和颗粒细胞中，FSH可以诱导胞外钙离子内流和胞内钙离子释放，在大鼠睾丸支持细胞中这一过程主要由Gαh/PLCδ1/IP3介导。在颗粒细胞中FSH诱导内质网钙离子释放的过程可能还有 APPL1接头蛋白的参与。

（3）FSHR与其他胞膜受体的相互作用

GPCR功能的广泛性和多样性除了归因于G蛋白本身作用的多样以外，还由于它能够与许多其他受体通过胞内效应分子发生作用，也可能通过受体之间形成二聚体发生，对FSHR来说，最常与其发生效应的是IGF-1R和表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor， EGFR）。

3.疾病相关

（1）FSH不敏感&过敏感综合征

✦FSH不敏感综合征系指 FSHR基因失活性突变引起的卵巢发育不全，临床表现为原发性或继发性闭经。亦称为未开发卵巢综合征（savage ovarian syndrome）、抵抗性卵巢综合征（resistant ovarian syndrome）等。在男性中，只有不同程度的生精障碍，除不育外无特殊表现。

✦FSHR活化性突变导致受体自主性激活，即在不存在FSH与受体结合的情况下，受体被自动活化，引起FSH过敏感综合征或家族性自发性卵巢过敏感综合征。

（2）肿瘤相关

FSH及其受体FSHR在肿瘤中的作用研究，最初主要集中在生殖系统肿瘤，如卵巢癌和前列腺癌等。近几年FSHR在其他肿瘤中的作用研究被不断报道。Radu等通过IHC、免疫印迹和原位杂交的方法对1336例临床手术切除的人前列腺、乳腺、结肠、胰腺、膀胱、肾、 肺、肝 、胃、睾丸和卵巢等各种肿瘤组织进行的分析表明，FSHR广泛表达于各种进程的肿瘤中，主要表达于肿瘤周围约10 mm厚范围内(肿瘤内外延伸)的新生血管的内皮细胞中。

（3）阿尔茨海默病（AD）

2022年3月2日，中国科学院深圳理工大学（筹）生命健康学院叶克强教授团队在 Nature 期刊发表的文章，首次揭示了FSH增高是女性比男性更容易罹患阿尔茨海默病（AD）的重要原因。研究表明，在更年期，FSH的血清浓度强烈增加，与神经元上的FSHR结合并激活C/EBPβ/AEP途径，这导致了Aβ和Tau的病变，进而引起了AD产生。

4.研究现状

全球已上市的促卵泡激素药物有尿源性促排卵激素（P-FSH）和重组人促排卵激素（rhFSH），主要是在辅助生殖治疗领域中用于促进女性排卵。国内丽珠集团生产的尿源促卵泡素占有中国尿源促卵泡素100%的市场份额，已实现进口替代。重组促卵泡素市场仍由原研厂商默克雪兰诺与欧加农主导，2015年，金赛药业的金赛恒上市打破了欧美企业的垄断，填补了中国市场国产重组促卵泡素的空白。中国已上市的促卵泡素产品主要有金赛药业的金赛恒、默克雪兰诺的果纳芬、欧加农的普丽康以及丽珠集团的丽申宝。

目前，中国批准的促卵泡素适应症有：

✦用于不排卵（包括多囊卵巢综合征，PCOS）且接受枸橼酸克罗米芬治疗无效者；

✦用于辅助生殖技术（如体外受精-胚胎移植（IVF-ET）、配子输卵管内移植（GIFT）及卵胞浆内精子注射（ICSI））中促排卵，以达到多个卵泡发育的目的。

5.NovoBio相关活性细胞株

✦案例展示

针对FSHR靶点药物的开发、生产放行和研究需求，NovoBio开发了FSHR-Luc/ HEK293细胞株，相比于FSHR检测试剂盒只能看到目标分子能否结合FSHR靶点，但看不到生物学活性及测试功能的情况，NovoBio活性细胞系不仅能测试浓度，还能获得功能和生物学活性的数据。部分数据展示如下：

FSH和报告基因细胞株表面的FSHR受体结合，从而激活细胞内下游信号通路，诱导报告基因Luciferase的表达，该荧光信号值Luciferase的高低和体系中FSH浓度或活性成正比。

图2.HEK293-FSHR-Luc  cell信号通路

✦数据展示

（1）HEK293-FSHR-Nluc细胞株表面FSHR流式检测

将细胞株HEK293-FSHR-Nluc细胞株与空细胞HEK293进行流式细胞实验，加入Fc-FSH 融合蛋白4℃孵育1小时后，接着加入Goat anti-human IgG Fc二抗4℃孵育1小时，流式检测结果显示阳性率是90%，该细胞株表面高表达FSHR。

图3. FSHR 表达流式结果图

（2）代次稳定性考察

考察细胞HEK293-FSHR-Nluc的代次稳定性，用p7、p17和p27次细胞研究发现，在p31次内该细胞株稳定释放报告基因，曲线表现一致，表现稳定，EC50变化在接受标准范围内，此细胞株在p31次内稳定。

图4. HEK293-FSHR-Nluc细胞株代次稳定性考察结果图

（3）专属性考察

用果纳芬和和不相关抗体human IgGs验证专属性，结果表明果那芬有明显的浓度依赖响应性号，而无关抗体human  IgGs无响应信号。

图5. HEK293-FSHR-Nluc细胞株专属性验证考察图

（4）优势特点

✅方法稳定，变动小；

✅实验窗口大，响应值高；

✅利用转基因构建的细胞可稳定传代；

✅该细胞株可以作为FSHR靶点蛋白活性检测的效应细胞；

✅适合放行、长期稳定检测，方便方法验证。

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