​深圳市人民医院李德峰老师的课题组在 Oxidative Medicine and Cellular Longevity 杂志上发表了研究论文 “Colonic Epithelial PHLPP2 Deficiency Promotes Colonic Epithelial Pyroptosis by Activating the NF-κB Signaling Pathway”， 研究了 Pleckstrin homology domain leucine-rich repeat protein phosphatase 2(PHLPP2) 对结肠上皮细胞焦亡的影响。研究发现 PHLPP2 的下调可以激活 NF-κB 信号通路的活性，诱导肠上皮细胞的焦亡，以及在溃疡性结肠炎中加剧结肠的炎症反应。因此 PHLPP2 对于溃疡性结肠炎的治疗，具有非常重要的临床意义。背景：溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性炎症性的疾病，在世界范围内的患病率在不断地增加。肠上皮细胞(IECs)的屏障缺陷是 UC 的主要发病机制之一。细胞焦亡(Pyroptosis)是一种程序性的溶解性的细胞死亡，主要由一些炎症性的 caspases 凋亡蛋白所引发。然后，细胞焦亡在 UC 中的作用目前却知之甚少。方法：通过将来自 GEO 数据集的 UC 患者与健康对照人群来进行比较，从而来筛选出与 UC 相关的差异表达基因(DEG)。也获得了可能参与细胞焦亡过程的候选基因，并在体内和体外同时探索了影响 UC 进展的潜在分子机制。结果：Pleckstrin homology domain leucine-rich repeat protein phosphatase 2(PHLPP2)，一种蛋白磷酸酶，通过生物信息学分析发现，该蛋白通过降低表达量来调节 NF-κB 信号通路，从而来参与调控炎症所诱导的 IEC 细胞焦亡的生理过程。此外，研究人员也证明了 PHLPP2 在 UC 患者和 UC 的小鼠模型中都发生了下调。同时，研究人员发现，在 UC 的小鼠模型中 PHLPP2 缺失所激活的 NF-κB 信号通路和 caspase-1 P20， Gasdermin N， IL-18, and IL-1β 表达的增加都有助于 IEC 细胞焦亡和炎症过程的发生。此外，研究人员还发现 PHLPP2^-/- 敲除小鼠对诱导结肠炎的葡聚糖硫酸钠(DSS)处理会产生超敏反应，NF-κB 信号通路被活化，并且会显著地诱导 caspase-1 P20， Gasdermin N， IL-18 and IL-1β 等基因的表达。并且，在 PHLPP2 敲除小鼠的肠类器官和胎结肠细胞中，这种炎症所诱导的 PHLPP2 基因表达的下调可被 NF-κB 信号通路的抑制剂所减缓。结论：PHLPP2 下调激活了 NF-κB 信号通路，并且促进了 IEC 的细胞焦亡，从而导致了 UC 的进展。因此，PHLPP2 基因可能是一个治疗 UC 的比较有潜力的候选靶标。

简介

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是一种在发达国家发病率比较高的慢性特发性的炎症性疾病，其在新兴的工业化国家的患病率也呈逐渐上升的趋势。在中国，几十年来 UC 的发病率迅速增加了近三倍。UC 是一种浅表性的结肠黏膜炎症，从直肠开始，并以连续的环形模式扩展到近端的结肠，其特征是该疾病的病程会产生周期性地复发和缓解。

UC 的发病高峰年龄为 30〜40 岁，会表现出一些症状，如便血，腹部不适和体重减轻，严重威胁着人类的健康，并影响生活的质量。尽管 UC 的发病机制仍不是十分得清楚，有些研究已经表明 UC 是一种多因素的疾病，涉及到遗传因素，环境因素，免疫系统的失调，上皮屏障的缺陷以及不适当的促炎细胞因子和趋化因子的产生。此外，患有 UC 的患者有比较高的犯结直肠癌的风险，尤其是在病程长，原发性硬化性胆管炎(PSC)和持续的炎症反应的情况下。

在 UC 的治疗中，维持病情的缓解和长期预防并发症，如残疾、结肠切除术和结直肠癌，至关重要。UC 的治疗是一种系统性的治疗，治疗方案主要以疾病的严重程度和范围为制定的依据。例如，5-氨基水杨酸(5-ASA)通常被用于对轻度至中度患者的治疗，而 5-ASA 的栓剂可以被用来对患有直肠炎的患者来进行治疗。皮质类固醇、硫嘌呤或生物类药物一般被用来对中到重度的患者来进行治疗，而手术常被用于对不受控制的炎症和并发症来进行治疗，例如穿孔、肠梗阻、结直肠癌或高度的发育不良等病症。

然而 UC 仍然是一个具有挑战性的医学问题，因为一些患者对现有的治疗没有反应。值得注意的是 UC 的发病机制在很大程度上仍不是非常地确定。在此次的研究中，通过对 GEO 数据集中 UC 患者标本的分析，数据显示在 UC 患者中 PHLPP2 基因的表达量发生了下调，并且这种下调促进了结肠上皮细胞的细胞焦亡，从而引发了结肠炎症的产生。此外，研究人员证明，在 UC 患者和 DSS 处理的小鼠模型中 PHLPP2 的表达都发生了显著地降低。

此外，在小鼠的肠类器官和胎结肠细胞(FHC)中 PHLPP2 功能的缺失促进了肠上皮细胞(IEC)的焦亡并导致了结肠的炎症反应。研究人员进一步证明 PHLPP2 的敲除直接激活了 NF-κB 信号通路的传导，促进了 IEC 细胞的焦亡，并且加剧了上皮细胞的炎症反应。总的来说，本次研究的结果表明 PHLPP2 可被作为一个治疗 UC 的可行的潜在靶点。

结果

1.生物信息学分析显示 PHLPP2 在 UC 中的表达会下降并参与调节细胞的焦亡
UC 的发病机制与遗传易感性有关。因此，研究人员对 GEO 数据集中可用的全转录组数据集进行了分析。研究人员发现来自于 GSE6731， GSE11223 and GSE38713 三个数据集的 UC 患者，与健康的对照人群相比，存在有显著性的表达差异(Fig.1.a)；Table S 1 显示，与健康的对照人群相比 UC 患者中有 41 个表达上调的基因和 16 个下调的基因(|log FC|>1.0, P<0.05)。另外 GO 分析显示，差异表达基因(DEGs)主要与体液免疫反应和中性粒细胞的迁移相关(Fig.1.b)；而 KEGG 的分析结果表明，这些 DEGs 也参与了细胞焦亡的生理功能的执行(Fig.1.c)。此外 GSEA 的分析结果表明，这些 DEGs 被显著的富集于发炎粘膜中的细胞因子-细胞因子受体的相互作用中(Fig.1.d)。总的来说，生物信息学的分析结果表明 PHLPP2 基因的表达下调可能会通过激活 NF-κB 的信号通路来影响 UC 患者结肠上皮细胞的细胞焦亡的产生(Fig.1.E)。

Fig.1

2.PHLPP2 在 UC 患者的发炎粘膜中会表达下调

众所周知，口服 DSS 会诱发肠道炎症，且所诱导的症状在临床和组织学上都与人类的 UC 比较相似。因此，可以通过在 C57 小鼠的饮用水中添加 4% DSS 来连续饲喂 7 天以诱发急性的结肠炎。与对照组相比 UC 组的体重减轻的更多，并且疾病的活动指数(DAI)也明显更大(Fig.2.a and b)。此外，与对照组相比 UC 组的结肠也明显更短(Fig.2.c and d)。此外 H&E 染色的结果显示 UC 组的结肠有明显的炎症和组织损伤(Fig.2.e)。此外 PHLPP2 and E-cadherin 和 PHLPP2 and Iba1 的共免疫荧光染色的结果表明 PHLPP2 主要表达在 IEC 中，而 PHLPP2 阳性细胞的比例在 UC 组中却发生了显著地降低(Fig.2.f)。

据报道 DSS 诱导的结肠炎能促进促炎性介质的释放。因此，通过 ELISA 检测，研究人员检测了血清中的 IL-18 和 IL-1β 的水平，而相较于对照组 UC 组中的 IL-18 and IL-1β 的水平发生了明显的增加(Fig.2.g and h)。

作为一种程序性的溶解性的细胞死亡的过程，与细胞凋亡和坏死不同，细胞焦亡与高度的炎症反应密切相关。据报道，炎症小体在激活 caspase-1 P20 之后 caspase-1 P20 将 Gasdermin D 裂解为 Gasdermin N 并诱导细胞的焦亡，随后导致 IL-18 and IL-1β 的分泌。与 IL-18 and IL-1β 的表达变化一致，与对照组相比，在 UC 组的结肠中 caspase-1 P20 and Gasdermin N 的表达都发生了显著地提升(Fig.2.I)。此外，据报道 LPS 可以促进肺内皮细胞的焦亡，并诱导 LDH 释放。因此，研究人员检查了 LDH 的活性，结果显示 UC 组小鼠结肠中 LDH 的活性要显著地高于对照组的小鼠(Fig.2.j)。

另外，研究人员发现与 24 名健康的对照人群相比，来自于 42 名 UC 患者的样本中的 PHLPP2 的表达发生了显著地下调(Fig.2.k)。总之，这些发现表明 PHLPP2 的下调可能会促进 IEC 细胞的焦亡并导致上皮炎症的发生。

 Fig.2

3.在体内 PHLPP2 缺失通过激活 NF-κB 信号通路来促进结肠上皮细胞的焦亡和炎症反应的程度
为了探索 PHLPP2 的缺失对结肠的影响，研究人员建立了 PHLPP2^-/- 基因敲除的小鼠模型。之后使用 4% DSS 来处理 PHLPP2^-/- and WT小鼠 7 天。与 WT 小鼠相比 PHLPP2^-/- 小鼠对 DSS 的处理表现出更显著的敏感性，并且小鼠的体重也发生了更明显的减轻和更大的 DAI 指数(Fig.3.a and b)。正如预期的那样 DSS 处理的 PHLPP2^-/- 小鼠具有较短的结肠长度(Fig.3.c and d)。此外 DSS 给药诱导的 PHLPP2^-/- 小鼠中的 IL-18 and IL-1β 的浓度也显著地增加(Fig.4.e and f)。此外，在 PHLPP2^-/- 小鼠中可以很明显地观察到组织损伤、隐窝丢失和炎症细胞的浸润等表型(Fig.3.g)。同样地 WB 实验的结果表明，在 PHLPP2^-/- 小鼠中 PHLPP2 的表达显著地被降低。与此相反 Akt， p-Akt， IKK， NF-κB p65， p-NF-κB p65， caspase-1 P20 and Gasdermin N 的表达在 PHLPP2^-/- 小鼠中都发生了显著地增加(Fig.3.h)。此外，在 PHLPP2^-/- 小鼠中 LDH 的活性也显著的更高(Fig.3.i)。因此 PHLPP2^-/- 敲除小鼠对 DSS 诱导结肠炎的过程会更敏感，这可能主要是因为 NF-κB 信号通路的激活和 IEC 细胞焦亡的产生。

Fig.3

4.在体外 PHLPP2 的缺失通过激活 NF-κb 的信号通路来促进结肠上皮细胞的焦亡
为了进一步来研究 PHLPP2 对 IEC 细胞焦亡调节作用的分子机制，研究人员通过从来源于 PHLPP2^-/- 和 WT 小鼠的单个细胞所培养而得的肠道类器官来进行了后续的研究(Fig.4.a)。研究表明，与 WT 小鼠相比 PHLPP2^-/- 敲除小鼠中的 PHLPP2 的表达发生了显著的降低(Fig.4.b)。用 LPS 处理类器官 24 小时以后，与 WT 组相比 IL-18 and IL-1β 的表达在 PHLPP2^-/- 敲除组中被显著地进行了上调(Fig.4.c and d)。与体内的研究结果一致 Akt， p-Akt， IKK， NF-κB p65， p-NF-κB p65， caspase-1 P20 and Gasdermin Ñ 的表达也受到了显著地上调(Fig.4.e)，并且 LDH 的活性在 LPS 处理后的 PHLPP2^-/- 组中也显著得增加(Fig.4.f)。然而 BAY11-7082 一种 NF-κB 信号通路的抑制剂，可以缓解炎症的反应，并且也能够显著地降低 PHLPP2^-/- 敲除类器官组中的IL-18, IL-1β and LDH(Fig.4.g-i) 和 caspase-1 P20 and Gasdermin N(Fig.4.j) 等基因的表达。总的来说，这些结果表明 PHLPP2 的缺失促进了结肠上皮细胞的焦亡，并且也通过激活 NF-κB 信号通路来促进了炎症反应的发生。

Fig.4

接下来，研究人员在 FHC 细胞中对 PHLPP2 的表达进行了沉默。结果表明，与对照组相比 PHLPP2-siRNA 沉默组中的 PHLPP2 的表达被显著地降低(Fig.5.a)。当用 LPS 对细胞进行 24 小时的处理后 IL-18 and IL-1β 的表达在 PHLPP2-siRNA 的沉默组中比对照组要显著提高很多(Fig.5.b and c)。同样地 AKT， p-Akt， IKK， NF-κB p65， p-NF-κB p65， caspase-1 P20 and Gasdermin Ñ 的表达和 LDH 的活性在 PHLPP2-siRNA 的沉默组也被显著地上调(Fig.5.d and e)。此外，扫描电子显微镜(SEM)的结果表明，在 PHLPP2-siRNA的沉默组中 FHCs 失去了膜的完整性并发生了细胞焦亡(Fig.5.f)。然而 NF-κB 的抑制剂 BAY11-7082 可以减轻 PHLPP2-siRNA 沉默组细胞中的炎症反应，并减少 IL-18, IL-1β and LDH 的表达(Fig.5.G-I)，同时 caspase-1 P20 and Gasdermin N 的表达也发生了下调(Fig.5.j)。因此，这些结果表明 PHLPP2 基因功能的缺失可以促进结肠上皮细胞的焦亡，并通过激活 NF-κB 的信号通路来促进炎症反应的发生。

Fig.5

讨论

 

细胞焦亡作为一种一般的先天免疫机制，主要通过经典的和非经典的途径来引发细胞的肿胀、裂解以及促炎细胞因子和细胞内内容物的释放。大量的研究表明，在经典的途径中 caspases-1 P20 将 Gasdermin D 裂解为 Gasdermin N 并在细胞膜上形成大量的孔，最终导致细胞的肿胀和裂解。有研究报导 caspase-1 P20 可以特异地将 Gasdermin D 裂解为 Gasdermin N 并介导小鼠巨噬细胞的焦亡，而 Gasdermin D 在不同的细胞和组织中都有广泛地表达，尤其是在胃肠道的上皮中有着较高的表达量。这些研究结果都表明，细胞焦亡并不仅仅只局限于小鼠的巨噬细胞中。在本次的研究中，研究人员首先证明，在 DSS 所诱导的小鼠中 caspase-1 P20 and Gasdermin N 的表达都显著地升高，并且 IL-18, IL-1β and LDH 的表达也显著地增加，这些结果都表明，在 UC 中可能会有细胞焦亡的发生。

PHLPP2 及其相关的旁系同源物 PHLPP1 都是 PHLPP 家族的成员，它们可以通过去磷酸化来抑制其下游靶标 Akt and PKC 的信号传导。因此 PHLPP2 在很多的细胞过程中都有着非常重要的作用，如抑制膀胱癌、抑制肝脂肪的变性和诱导 IEC 细胞的凋亡。在本次的研究中，研究人员证明了 PHLPP2 表达定位于 IEC 中，并且在 UC 患者的人体组织和 DSS 所诱导的小鼠中 PHLPP2 的表达都显著地降低。事实上，相较于野生型的小鼠，当用 DSS 来进行处理诱导后 PHLPP2^-/- 敲除的小鼠表现出更多的体重减轻、更短的结肠长度和更高的 DAI 指数，并且在敲除小鼠中 caspase-1 P20， Gasdermin N， IL-18， IL-1β and LDH 的表达也更高。这些发现都表明，在 PHLPP^-/- 敲除的小鼠中 PHLPP2 功能的缺失加剧了结肠炎的发生。此外，当用 4% 的 DSS 来对取自于 PHLPP^-/- 敲除小鼠和野生型小鼠结肠细胞中的类器官来进行处理后，敲除组中的 caspase-1 P20， Gasdermin N， IL-18， IL-1β and LDH 的表达都显著地发生了增加。因此，结果表明 PHLPP2 的敲除引发了结肠上皮细胞的焦亡并促进了结肠炎的进展。然而 Wen et al. 等人也证明了 PHLPP2 的敲除激活了 NF-κB 信号通路并抑制了 IEC 的凋亡。

众所周知，信号通路参与了细胞的焦亡，从而促进了细胞内促炎细胞因子和趋化因子的释放并诱导了炎症。在本次的研究中，研究人员发现 PHLPP2 的下调，增强了对 NF-κB 信号通路的激活；增强了 Akt， p-Akt， IKK， NF-κB p65， p-NF-κB p65， caspase-1 P20， Gasdermin N， IL-18， IL-1β and LDH 的表达；促进了 IEC 的焦亡；并加剧了结肠炎症的反应。然而 NF-κB 的抑制剂可以抑制细胞的焦亡并减轻炎症的反应。因此，这些发现都证明了 PHLPP2 的下调不仅促进了 IEC 的焦亡，而且通过激活 NF-κB 信号通路也加剧了结肠的炎症反应。有趣的是，最近有研究表明 NF-κB 信号通路的激活可以诱导肾小管细胞的焦亡，并会促进肾脏疾病中肾小管损伤的进展，而这与本次研究中研究人员所获得的结果是一致的。另外，已经被证实 NF-κB 信号通路的抑制会减缓 IBD 中粘膜的炎症反应。也有研究表明 IKKs 包括 IkB Kinases a and b 是激活 NF-κB 复合物和 IKK 激酶复合物的主要蛋白激酶，而 IKK 激酶复合物是 NF-κB 所介导的炎性通路的关键因子。此外 Akt 激酶可以通过 IKK 磷酸化来激活 NF-κB 信号通路。然而，已经有研究证明 PHLPP2 可以通过去磷酸化来失活 Akt 从而导致 NF-κB 信号通路的抑制。因此，研究人员认为 PHLPP2 的下调可以激活 NF-κB 信号通路的活性，诱导 IEC 的细胞焦亡，以及在 UC 中加剧结肠的炎症反应(Fig.6)。总而言之，研究人员第一次表明了 PHLPP2 的下调可以直接激活 NF-κB 信号通路，并促进 IEC 的细胞焦亡，从而导致了 UC 中结肠炎的进展。因此，这些结果表明 PHLPP2 可能是研究 UC 的一个极具价值的潜在治疗靶点。

Fig.6