山东大学张澄、张运和张猛老师的课题组在 Science Translational Medicine 杂志上发表了研究论文 “Erythropoietin promotes abdominal aortic aneurysms in mice through angiogenesis and inflammatory infiltration”，研究了促红细胞生成素(EPO)可能会促进腹主动脉瘤(AAA)形成的猜想。研究发现，高剂量的 EPO 可以同时促进 Apoe^-/-(66.7%) 敲除小鼠和野生型(WT)(60%)小鼠中的 AAA 的形成，并且这一过程是 EPO 剂量依赖性的。使用 EPO 单克隆抗体来干预接受血管紧张素 II(AngII) 刺激的 Apoe^-/- 小鼠，可以很明显的降低小鼠中 AAA 的发生率(从 86.7% 到 20%, P<0.001)；同时，相较于 Apoe^-/- 敲除小鼠，通过基因编辑的手段被敲降 EPO 受体表达量的 Epor^+/-Apoe^-/- 小鼠，在被 AngII 刺激后 AAA 的发生率被显著的降低了(从 86.7% 到 45.5%, P<0.05)。这两点都进一步地支持了 EPO 对 AAA 的形成，具有非常显著的贡献。该研究还表明 EPO 诱导的 AAA 还导致了微血管的增加、吞噬细胞的浸润和基质金属蛋白酶的分泌的增加，以及胶原蛋白和平滑肌细胞(SMC)的减少等症状。体内和体外的实验也表明 EPO 是通过 JAK2/STAT5 信号通路来诱导内皮细胞的增殖、迁移和微血管的形成的。临床研究表明，在人类 AAA 患者的血清中 EPO 的浓度要明显的高于健康人的，并且与 AAA 的大小显著相关，这表明 EPO 的浓度与人类 AAA 的严重程度间存在有潜在的联系。总而言之，该研究表明 EPO 不仅可以在 Apoe^-/- 敲除小鼠中，同时也可以在野生型的小鼠中，通过增强血管生成、炎症反应、胶原降解和 SMC 凋亡等方式来促进 AAA 的形成。并且 EPO/EPOR 信号通路对于 AngII 诱导的 AAA 的产生也是不可或缺的。因此 EPO 对于 AAA 的治疗，具有非常重要的临床意义，然而 EPO 和 AAA 在临床上的关联，还需要再进行进一步的研究。

简介

腹主动脉瘤(AAA)是一种潜在可致命的血管类疾病，当腹主动脉局部发生扩张，直径大于 3cm 或超过正常主动脉直径的 50% 即可被确认为形成了腹主动脉瘤。发生 AAA 的患者通常无症状，直到主动脉发生破裂，死亡率为 85% 至 90%。 尽管在探索 AAA 的发病机制方面取得了进展，但尚无临床生物标志物或药物治疗可有效的降低 AAA 发展的风险或限制其进展。

在多种 AAA 的动物模型中，向 Apoe^-/- 敲除小鼠中注射血管紧张素 II(AngII) 是目前最常用的构建 AAA 模型的方法，该模型表现出与人类在临床中所发现的比较一致的病理特征，包括炎症的浸润、细胞外基质(ECM)的降解、血管生成、氧化应激和血栓形成等。先前的临床研究表明，接受过血管内修复术的 AAA 患者中有多达三分之一的患者患有贫血，并且低水平的循环血红蛋白的浓度与 AAA 的大小显著相关，尽管这种关联的机制尚不清楚。最近的一项研究表明，在 AngII 诱导的高脂血症小鼠中，抑制缺氧诱导因子 1α (HIF-1α) 可以减缓 AAA 的进展。慢性贫血和 HIF 可能会引发促红细胞生成素(EPO)生成的增加，最近也有证据表明 AngII 可能是通过直接刺激造血祖细胞的受体或间接调节 EPO 基因的表达来影响造血的。据报道，有一个罕见的 AAA 的病例，就是有一名接受慢性血液透析并反复接受高剂量重组人 EPO 的患者所引发的。这些临床和实验研究都表明 EPO 和 AAA 之间存在着一种未知的联系。

EPO 是调节红细胞生成的主要细胞因子，主要在胎儿的肝脏和成人的肾脏中生产。EPO 的主要作用是刺激红细胞系统中的 EPO 受体(EPOR)并诱导红细胞的生成。最近的研究发现 EPO 通过在非造血组织中表达的 EPOR 也具有造血之外的功能。例如 EPO 可以通过促进内皮细胞(EC)的增殖和迁移以及基质金属蛋白酶 2(MMP2)的产生来刺激新血管形成。尽管之前的研究发现 EPO 可以通过抑制心肌细胞的凋亡和增强 ECs 产生 NO 的功能来发挥保护心脏的作用，但最近的一项 meta 分析表明 EPO 治疗对心脏功能、梗死面积、心血管病变和急性心肌梗死患者的死亡率没有任何的效果。此外，血清中高浓度的 EPO 与心力衰竭的风险增加有很明显的相关性。然而 EPO 和 AAA 之间的关系仍然未知，在该研究中，研究人员对 EPO 是否是通过血管生成和炎症反应等方式来促进 AAA 的形成的假设来进行了研究。

结果
 1.EPO 以剂量依赖式的方式可以同时在 Apoe^-/- 敲除小鼠和野生型小鼠中诱发 AAA 的形成

对 Apoe 敲除小鼠来进行 EPO 注射，随着注射剂量的增加，小鼠的死亡率也增加(Fig.1A)；研究人员首先检查了 EPO 注射是否可以在喂食高脂肪饮食(HFD)的 Apoe^-/- 小鼠中引发 AAA。EPO 处理 4 周后以剂量依赖性的方式增加了 AAA 的发生率(低剂量为 26.7% 中剂量为 40% 高剂量为 66.7%, Fig.1B)和腹主动脉的直径(Fig.1C)。四组 Apoe^-/- 敲除小鼠的主动脉标本的图片如图 Fig.1D 所示。与生理盐水处理的对照组相比 EPO 注射增加了这些小鼠中的主动脉壁的厚度并促进了弹性层的降解(Fig.1, E and F)。

对野生型小鼠来进行 EPO 注射，随着注射剂量的增加，小鼠的死亡率也发生了增加(Fig.2A)，与在 Apoe^-/- 小鼠中观察到的死亡率类似。研究人员也检查了 EPO 对胆固醇水平正常的 WT 小鼠的影响，结果显示 EPO 注射 WT 小鼠 4 周后，也增加了 AAA 的发生率和腹主动脉的直径(Fig.2, B and C)，特别是在高剂量的 EPO 处理组的小鼠中 AAA 的发生率高达 60% 而 AngII 诱导 AAA 的发生率仅为 13.3%。 四组 WT 小鼠的主动脉标本的图片如图 Fig.2D 所示。与使用生理盐水处理的对照组相比 EPO 注射增加了主动脉壁的厚度，并且也促进了弹性层的降解(Fig.2, E and F)。


2.血管生成有助于 EPO 在 Apoe^-/- 和 WT 小鼠中来诱导 AAA 的形成

由于与血管形态发生相关的大部分基因也参与了血管的生成，因此，研究人员重点对对照组和中等剂量 EPO 处理组小鼠中分离出来的主动脉来进行了研究，检测并评估了这些样本中与血管生成相关的基因和分子。标记蛋白染色实验的结果显示，相比于对照组，中等剂量 EPO 处理组小鼠中的微血管的密度要更大(P<0.01; Fig.3, A and B)；通过免疫组化和 WB 的实验检测，结果显示中等剂量 EPO 处理组小鼠中的 MMP2, MMP9 and MT1-MMP 的蛋白的表达量都要明显的高于对照组(Fig.3, A to D)，并且通过 zymography 实验检测，结果显示出 MMP2 and MMP9 的活性在实验组和对照组中也表现出了类似的变化(P<0.01 and P<0.01; Fig.3, E and F)。此外，在 Apoe^-/- 敲除小鼠中，相较于对照组，中等剂量的 EPO 处理可以显著的减少平滑肌细胞(SMC)和胶原蛋白的生成和累积(P<0.001 and P<0.001; Fig.3, A and B)，尤其是 I 型胶原蛋白(Col I)和 III 型胶原蛋白(Col III)(P<0.05 and P<0.001; Fig.3, C and D)，这表明 EPO 处理诱导了 ECM 的降解。由于 MMP 的激活是血管生成的关键步骤，所以研究人员认为增强的 MMP 活性可能有助于血管的生成和加速 AAA 的形成。研究人员选择了几个与血管生成相关的候选基因，包括血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、激酶插入域蛋白受体(KDR)和酪氨酸蛋白激酶受体 Tie-2(Tie2)。 正如预期的那样，与对照组相比，中等剂量的 EPO 处理显著的增加了腹主动脉中 VEGF, TGF-β1, KDR and Tie2 蛋白量的表达(P<0.05, P<0.01, P<0.05, and P<0.05, respectively; Fig.3, G and H)。

3.炎症反应有助于 EPO 在 Apoe^-/- 和 WT 小鼠中来诱导 AAA 的形成

研究人员进一步研究了 EPO 处理是否会如 RNA-seq 分析所表明的那样会加重炎症反应的发生。通过对主动脉壁的组织病理学的检测，结果显示，与对照组相比，中等剂量的 EPO 的处理促进了吞噬细胞在主动脉壁中的聚集以及促炎细胞因子在主动脉壁中的表达，包括细胞间细胞粘附因子 1(ICAM-1)、血管细胞粘附因子 1(VCAM-1)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-1β、单核细胞趋化蛋白 1(MCP-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(Fig.3, I and J)。蛋白免疫印迹(WB)和定量 PCR(RT-PCR)分析均显示，中等剂量 EPO 处理小鼠动脉组织中的 CD68, ICAM-1, VCAM-1, IL-6, IL-1β, MCP-1 and TNF-α 基因的 mRNA 和蛋白的表达量都要显著的高于对照组小鼠中的(Fig.3, K to M)；此外，研究人员还测量了两组小鼠的血清中的炎症因子的浓度，发现与对照组相比，中等剂量 EPO 处理组小鼠中的 IL-6, IL-1β, MCP-1 and TNF-α 的含量都发生了明显的增加(Fig.3N)。这些数据都表明，动脉壁的局部的炎症和全身性的炎症反应都参与了 EPO 所诱导的 AAA 的形成。

接下来研究人员比较了不同处理组的小鼠血清中的 EPO 的浓度。相较于对照组，在 AngII 所诱导的 Apoe^-/- 和 WT 小鼠的血清中的内源性的 EPO 浓度比对照组要增加两倍以上(P<0.001 和 P<0.05)，这表明 AngII 处理可能会诱导 EPO 的分泌。此外 AngII 所诱导的 Apoe^-/- 敲除小鼠血清中的内源性的 EPO 的浓度要高于 AngII 所诱导的 WT 小鼠(P<0.01)，这可能也解释了前者的 AAA 的发生率要高于后者的原因。

为了确定在人中 EPO 和 AAA之间的关系，研究人员比较了 136 例 AAA 患者和 92 个健康人的血清中的 EPO 的水平。表 1 显示了 AAA 患者和健康人的临床的特征。结果显示，与健康人相比 AAA 患者血清中的 EPO 的浓度要显著的高于健康人的。此外，与健康人相比，患有 AAA 的患者比较常见于具有以下一些特征的人群中：年龄大、抽烟、高血压、糖尿病、高血尿素氮和阿司匹林、stain、血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素受体阻断剂(ARB)、钙通道阻断剂(CCB)的使用等。经过统计分析，研究人员进一步的确认，只有吸烟和血清 EPO 的浓度是与 AAA 相关的危险因素，并且也发现 AAA 患者的腹主动脉的直径是与其血清中的 EPO 的浓度是密切相关的。

Table 1

6.在体外的内皮细胞中 EPO 处理可以诱导细胞的增殖、迁移、以及微管的形成和 MMP 的分泌
 

为了研究 EPO 诱导 AAA 的基础机制，研究人员对含有在主动脉壁中所存在的多种不同类型的细胞的原代培养细胞来进行了研究。相比于平滑肌细胞和巨噬细胞 EPOR 在内皮细胞中的表达量最高(Fig.5A)，这也表明 EPO 可能是主要作用于内皮细胞的。之后，研究人员研究了 EPO 对初级内皮细胞的作用(人脐静脉内皮细胞 HUVECs 和人主动脉内皮细胞)，结果表明，与对照组相比 EPO 的处理促进了 EC 的增殖(Fig.5, B and C)、迁移(Fig.5, D to G)和微管的形成(Fig.5, H and I)。此外，相较于对照组，在主动脉环中 EPO 能够诱导 EC 的萌发(Fig.5, J and K)。这些结果都表明 EPO 主要是直接作用于 EC 并促进血管生成的。

先前有研究报道 MMP 可以通过降解 ECM 来促进 EC 的侵入，从而来促进血管的生成。因此，接下来研究人员研究了，在 EPO 刺激内皮细胞的情况下 MMP2, MMP9 and MT1-MMP 的改变。结果显示，相较于对照组 MMP2, MMP9 and MT1-MMP 的蛋白表达量，以及 MMP2 and MMP9 的活性，在 EPO 刺激 24h 后都发生了显著的增加(Fig.5, L to O)。因此 EPO 的处理增强了 MMP 在 EC 中的表达和活性。接下来，研究人员检测了几种与血管生成有关的受体的表达。正如预期的那样 KDR and Tie2 的蛋白表达量相较于对照组都发生了明显的增加(Fig.5, L and M)。

Fig.5

7.EC 细胞对于 EPO 所诱导的炎症反应、胶原降解以及 SMC 的凋亡都是必不可少的
 

首先，研究人员证实了与对照组相比，中等剂量的 EPO 的处理可以诱导吞噬细胞浸润的增加(Fig.3I)，然后，研究人员在体外检查了巨噬细胞是如何参与 EPO 所诱导的炎症反应的。通过 monocyte adhesion assay 实验，结果显示，与对照组相比，仅用 EPO 刺激 24 小时即可导致粘附在 HUVEC 上的人 THP-1 细胞的数量增加了 9 倍(P<0.001; Fig.6, A and B)，所以，单核细胞的粘附可能会受 EPO 所影响的 HUVECs 的趋化性和/或促炎作用的影响。为了区分这两种效应，研究人员用单独的 EPO 或用 EPO 预刺激的 HUVEC 培养基对巨噬细胞来进行了处理，持续 24 小时(Fig.6C)。相较于体外的基础的表达量，单独的 EPO 的处理并不会导致巨噬细胞中的 IL-6, IL-1b, TNF-α and MCP-1 的 mRNA 的表达量发生很明显的变化。然而，与基础表达量相比，用 EPO 预处理的 HUVEC 培养基所处理的巨噬细胞中，这些炎性细胞因子的 mRNA 的表达都得到了显著的增加(Fig.6D)。这些结果表明，巨噬细胞中的炎症反应是由 EPO 通过 ECs 来进行诱导的。

为了检查 SMC 的作用，研究人员仅用 EPO 对 SMC 来进行了处理，但未检测到胶原蛋白和 MMP 蛋白相对于基础表达有很明显的变化。然而，与用对照组所预处理的 HUVEC 培养基来进行处理的 SMC 相比，用 EPO 预处理的 HUVEC 的培养基来进行处理后的细胞中的 Col I and Col III 的表达发生了显著的降低，但却增加了 SMC 中的 MMP2 and MMP9 的表达和活性(Fig.6, E to H)。因为 Col I 和 Col III 是 ECM 的重要组成部分，并且 MMP 也可以降解 ECM, 所以，这些结果表明 SMC 可能参与了 EPO 所诱导的 ECM 的降解。接下来，研究人员研究了 EPO 是否会影响到 SMC 细胞的凋亡和增殖，发现单独的 EPO 并不会改变 SMC 细胞的凋亡或增殖，而用 EPO 预处理的 HUVEC 的培养基却增加了 SMC 细胞的凋亡并减少了增殖(Fig.6, I to N)。这些结果表明 EPO 是通过 ECs 来诱导 SMC 的凋亡的。

Fig.6

8.EPO 可以在离体组织中促进血管的生成和吞噬细胞的浸润

为了进一步阐明 EPO 是否可以促进血管的生成和炎症反应，研究人员将含有或不含 EPO (50 IU/ml) 的 Matrigel plugs 皮下注射到 WT 小鼠中。注射两周后，将 Matrigel plugs 切除下来，并用福尔马林固定包埋。不含 EPO 的 Matrigel plugs 呈黄色，但含有 EPO 的 Matrigel plugs 呈红色(Fig.7A)，这表明 Matrigel plugs 内形成了血管。组织学检测显示，与对照组相比，含有 EPO 的 Matrigel plugs 中的侵入细胞和血管的数量都发生了增加(Fig.7B)，这表明 EPO 促进了细胞的迁移和新血管的形成。随后，研究人员用 CD144(一种 EC 标记) 和 Ki67(增殖标记) 对 Matrigel plugs 切片来进行了双重的免疫染色，以显示出增殖细胞群。结果显示含有 EPO 的 Matrigel plugs 中的 Ki67⁺ 增殖的 EC 的数量要明显的高于对照组中的(P<0.001; Fig.7, C and D)，这表明 EPO 促进了 EC 的增殖和迁移。此外，在含有 EPO 的 Matrigel plugs 中的 CD68, IL-6, IL-1β, MCP-1 and TNF-α 蛋白的表达量也要显著的高于对照组中的(Fig.7, E and F)，这表明 EPO 促进了吞噬细胞的侵袭并增强了炎症因子的分泌。

9.JAK2/STAT5 信号通路介导了 EPO 所诱导的血管生成

通过对 EPO 和对照所诱导的主动脉组织的 RNA-seq 的结果显示，在 EPO 处理组中与 JAK/STAT 通路相关的基因发生了显著的改变。因此，研究人员又在 HUVEC 中对 JAK2/STAT5 通路是否参与 EPO 所诱导的血管生成来进行了检测。结果显示，在 HUVEC 细胞中 EPO 处理组中的 JAK2 and STAT5 的磷酸化的水平要明显的高于对照组(Fig.7, G and H)，这表明 EPO 激活了 JAK2/STAT5 信号通路。之后，研究人员在 HUVEC 细胞中使用 TG101348(一种 JAK2 选择性的抑制剂) and CAS 285986-31-4(一种 STAT5 抑制剂)来抑制该信号通路，发现 EPO 处理后的 JAK2 and STAT5 的磷酸化水平相较于对照组发生了显著的下降(Fig.7, G and H)。在微管形成的实验中，用 JAK2 抑制剂或 STAT5 抑制剂来处理细胞，结果显示 EPO 对 HUVEC 的促血管生成作用被消除了(Fig.7, I and J)。因此，结果表明 EPO 主要是通过 ECs 中的 JAK2/STAT5 通路来诱导血管生成的。

Fig.7

讨论

该研究发现 EPO 可以以剂量依赖性地方式来促进 AAA 的形成，在接受高剂量的 EPO 所诱导的 Apoe^-/- 和野生型(WT)小鼠中的 AAA 的形成率分别为 66.7% and 60%。 而对 AngII 所处理的 Apoe^-/- 小鼠再给予 EPO 单克隆抗体的处理，可以导致 AAA 的发生率发生显著的降低(从 86.7% 到 20%, P<0.001)。同样的，与 Apoe^-/- 小鼠相比，使用 AngII 来诱导 EPO 受体(EPOR)敲低 Epor^+/-Apoe^-/- 的小鼠 AAA 的发生率也发生了显著的降低(从 86.7% 到 45.5%, P<0.05)。以上结果都表明 EPO 是导致 AAA 形成的重要影响因素。

EPO 在诱导 AAA 形成的同时，也会伴随有微血管的增加、吞噬细胞的浸润和基质金属蛋白酶的增加，以及胶原蛋白和平滑肌细胞(SMC)的减少。体外和离体的实验结果都表明 EPO 可以通过 JAK2/STAT5 信号通路来诱导内皮细胞的增殖、迁移和微管的形成。同时，在人类中 AAA 患者的血清中的 EPO 的浓度要明显的高于健康的人，并且与 AAA 的大小密切相关，这表明 EPO 与人类 AAA 的严重程度之间存在有潜在联系。

综上所述，该研究发现了 EPO 可以通过增强血管的生成、炎症、胶原降解和 SMC 的凋亡来促进 Apoe^-/- and WT 小鼠中 AAA 的形成，并且 EPO/EPOR 信号通路对于 AngII 所诱导的 AAA 是至关重要的。而在临床上，人体中的 EPO 和 AAA 之间的关联需要来进行进一步的研究。 本研究中所使用的 Epor 敲除小鼠由北京唯尚立德提供，该小鼠是在 C57BL/6 的背景下通过 CRISPR/Cas 9 技术构建而成的。北京唯尚立德生物科技有限公司是拥有多年的基因编辑经验，已为数千名科研工作者及工业客户成功定制基因编辑模型，同时搭建了完善的基因工程动物创制平台、动物表型分析和实验技术服务平台、动物模型种源交流平台、实验动物繁育平台，欢迎您致电咨询。

原文链接：

https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aaz4959