细胞周期蛋白依赖性激酶16 (CDK16)是一种非典型的PCTAIRE激酶，其活性依赖于细胞周期蛋白Y (CCNY)家族。CCNYs已被报道调节乳腺干细胞的活性和乳腺的发育，是多种癌症中的一种癌蛋白。然而，目前尚不清楚CDK16是否在乳腺癌中发挥作用，以及是否可以作为乳腺癌的治疗靶点。鉴于此，有相关研究提出CDK16在三阴性乳腺癌（TNBC）中起着关键作用，是一种新的TNBC治疗靶点，该研究在2022年4月发表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF：11.161。

技术路线：
 

主要研究结果：

1. CDK16在TNBC中高表达，且与不良临床结果相关

       作者分析了CCNY依赖性非典型CDKs的表达和临床相关性，发现CDK16在所有乳腺癌亚型中均有表达，在基底样乳腺癌样本中表达最高(图1A)。此外，CDK16高表达与不良预后显著相关(图1B-D)。与TCGA数据集的结果一致，乳腺癌联合数据库(图1E)和GSE76250数据集(图1G)也发现TNBC中CDK16表达水平高于正常乳腺组织，且CDK16高表达与不良临床结果呈正相关(图1F)。此外，CPTAC数据库分析显示，乳腺肿瘤组织中CDK16蛋白表达较正常乳腺组织显著升高(图1H)。在所有乳腺癌亚型中，CDK16仅在TNBC中升高(图1I)。使用组织芯片（T=50, P=4）进行免疫组化(IHC)分析，免疫组化分析显示，TNBC肿瘤中CDK16蛋白的表达明显高于邻近的非癌组织，并主要分布在细胞质中(图1J)。临床样本（N=6, T=6）检测进一步证实了TNBC中CDK16蛋白表达的增加（图1K）。这些数据表明高表达的CDK16可能在TNBC的进展中发挥作用。
 

图1 CDK16在TNBC中高表达，与不良临床结果相关

2. 抑制CDK16在体内外均可抑制TNBC的肿瘤生长

       集落形成分析显示，CDK16敲低显著降低了TNBC细胞的增殖和克隆能力(图2A, B)。为了确定CDK16的功能是否取决于其酶活性，通过靶向CDK16 3’-UTR的shRNA耗尽内源性CDK16，然后恢复shRNA耐药的野生型CDK16 (CDK16)或激酶不活化的CDK16D304A突变体(D304A)。尽管过表达效率相当(图2C)，野生型CDK16而非CDK16D304A突变体可以挽救2D-colony形成分析显示的细胞增殖缺陷(图2D, E)，这表明CDK16在TNBC中的功能需要激酶活性。

       进一步使用两个细胞系来源的异种移植(CDX)模型来研究CDK16在TNBC进展中的作用。CDK16基因敲除（CDK16-KD）显著延迟了异种移植瘤模型的肿瘤形成(图2F)，抑制了肿瘤生长，与对照组相比，CDK16-KD组的肿瘤体积、质量和大小都有所减少(图2G-I)。另一种异种移植模型得到了一致的结果(图2J-M)。总之，这些结果表明CDK16对TNBC进展至关重要。

 

图2 CDK16敲低可抑制TNBC的体内外肿瘤生长

3. 在患者来源的类器官和异种移植模型中，CDK16的下调抑制TNBC的肿瘤进展

        考虑到临床意义，建立了PDO和PDX模型(图3A)，以进一步评估靶向CDK16在TNBC中的治疗效果。与CDX模型的观察结果一致，在所有三个PDO模型中，与对照组相比，CDK16-KD组的类器官形成效率和类器官生长显著降低 (图3B-D)，表明CDK16敲低抑制了TNBC的进展。类器官Ki67染色分析显示，CDK16-KD组各类器官中Ki67+细胞的比例明显低于对照组，对应于CDK16-KD类器官的增殖抑制表型(图3E)。PDX模型的结果进一步验证了靶向CDK16在TNBC中的抗肿瘤作用：减缓肿瘤发生(图3F)，抑制肿瘤生长(图3G)，最终抑制肿瘤进展(图3H, I)。综上所述，这些数据表明靶向CDK16在TNBC的临床治疗中具有巨大的潜力。
 

图3在患者来源的类器官和异种移植模型中，CDK16的下调抑制TNBC的肿瘤进展

4. CDK16促进TNBC细胞迁移和肿瘤转移

       乳腺癌患者CDK16表达与转移复发风险呈正相关，提示CDK16可能参与TNBC转移。为了验证这一可能性，通过生物发光成像(BLI)定量监测体内肿瘤转移。western blot分析证实CDK16过表达(CDK16-OE) (图4A)。Transwell和愈合化验显示，CDK16-OE显著提升细胞入侵和迁移(图4 B, C)。体内,老鼠的metastasis-free生存时间轴承CDK16-OE细胞相比明显缩短小鼠的轴承控制细胞(图4 d, E)，而CDK16-OE严重加重肺转移负担 (图4D, F)和肺转移结节(图4G, H)。H&E分析显示，CDK16-OE导致肺组织严重结构损伤(图4G)。而CDK16-KD显著降低了4T1细胞的远端器官转移(图4I)，而CDK16-OE过表达显著促进了EMT6细胞向多个器官的远端转移，这在体内和体外BLI数据中得到了证实(图4J)。总之，这些结果表明CDK16对TNBC转移至关重要。

 

图4 CDK16促进TNBC细胞迁移和肿瘤转移

5. CDK16通过磷酸化PRC1和调节纺锤体形成来调控细胞增殖

       为了研究CDK16参与TNBC进展的分子机制，通过RNA测序分析了CDK16-KD MDA-MB-231细胞和对照细胞的转录组。先前文献报道CDK16与纺锤体有关，同GO分析一样。因此检测有丝分裂过程中的纺锤体形成，观察到CDK16-KD MDA-MB-231细胞中有明显的纺锤体形成缺陷(图5A)。免疫印迹分析显示，T481位点（CDK依赖的主要磷酸化位点）的PRC1磷酸化随着细胞周期过程中CDK16蛋白的丰度而波动（图5B），并且在MDA-MB-231细胞中，CDK16敲除后PRC1的磷酸化水平明显降低（图5C）。此外，在CDK16敲除后，PRC1靶向基因的表达显著改变：细胞周期相关基因下调，凋亡相关基因上调(图5D)。PRC1的亚细胞定位决定了其在细胞增殖中的作用，通过免疫染色(图5E)和免疫印迹分析(图5F)，进一步观察到PRC1在CDK16-KD细胞中明显的核滞留。

        MDA-MB-231细胞的2D增殖分析显示，磷酸化模拟的PRC1^T481D突变体显著拯救了受抑制的细胞增殖，而磷酸化缺失的PRC1^T481A突变体则没有这种拯救作用(图5G, H)。提示CDK16对TNBC细胞增殖的调控作用是通过磷酸化PRC1实现的。综上所述，这些结果表明CDK16通过磷酸化PRC1来发挥其在TNBC中的功能。

 

图5 CDK16通过磷酸化PRC1和调节纺锤体形成来调控细胞增殖

6. CDK16药理抑制可抑制TNBC的肿瘤生长和转移

       与TNBC细胞系相比，细胞系MCF-7和T47D对Reb（CDK16抑制剂）敏感性较低(图6A)。免疫印迹分析显示，Reb处理降低了T481位点的PRC1磷酸化，并导致PRC1的核保留(图6B, C)。Reb治疗显著抑制肿瘤生长，从单个肿瘤体积、平均肿瘤体积、肿瘤重量和肿瘤大小可以看出(图6D-G)。在PDO模型中，Reb存在时肿瘤类器官的大小和数量均显著减少，但Abe (CDK4/6抑制剂，作为对照)不存在(图6H, I)。Ki67和cleaved caspase-3的免疫染色评估显示只有Reb诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖(图6J)。在PDX模型中，也观察到Reb具有显著的抗肿瘤效率 (图6K-N)。Reb能有效抑制MDA-MB-231肿瘤细胞的肺转移（图6O,6P）。综上所述，药理抑制CDK16可有效抑制TNBC的肿瘤生长和转移，CDK16可作为治疗TNBC的一个有希望的靶点。

 

图6 CDK16药理抑制作用对TNBC肿瘤生长和转移的抑制作用

7. CDK16抑制参与多种癌症相关信号通路

       Reb治疗后的MDA-MB-231细胞进行了转录组分析。GSEA分析显示，在Reb处理的细胞中，有丝分裂纺锤体组织的基因标记(图7A)和G2/M检查点(图7B)下调。Rb-E2F基因标记也受到了Reb治疗(图7C)或CDK16敲除(图7D)的影响。热图显示，Rb-E2F途径的靶基因在Reb处理（图7E）或CDK16敲除（图7F）后下调。免疫印迹分析证实，在Reb治疗（图7G）或CDK16敲除（图7H）后，Rb磷酸化显著降低。此外，通过qPCR分析，Reb治疗（图7I）或CDK16敲除（图7J）后，受Rb-E2F信号直接调节的基因表达显著下调。总之，这些结果表明CDK16通过磷酸化Rb来调节Rb-E2F信号。综上所述，这些数据支持CDK16抑制参与多种癌症相关信号通路，这可能有助于CDK16与PRC1共同调控TNBC进展。

 

图7 CDK16抑制参与多种癌症相关信号通路

结论

        CDK16在乳腺癌，尤其是TNBC中高表达，其高表达与不良预后相关，促进TNBC的恶性活动。机制上，CDK16通过磷酸化PRC1和调节有丝分裂期间纺锤体的形成发挥致癌作用。有趣的是，CDK16抑制也抑制Rb磷酸化和Rb-E2F信号。总之，该研究为非典型CDK在癌症中的作用提供了新的见解，并强调CDK16是TNBC一个有希望的治疗靶点。

参考文献

Li X, Li J, Xu L, Wei W, Cheng A, Zhang L, Zhang M, Wu G, Cai C. CDK16 promotes the progression and metastasis of triple-negative breast cancer by phosphorylating PRC1. J Exp Clin Cancer Res. 2022;41(1):149. doi: 10.1186/s13046-022-02362-w.