CRISPR/Cas9 gRNA 文库筛选服务——精准筛选出功能基因

CRISPR/Cas9 是细菌和古生物菌用来抵抗外来质粒或噬菌体等遗传物质入侵的一种获得性免疫系统。该系统自从 2011 年被张锋实验室等进行改进和应用，迅速在基因编辑领域占据了绝对的主导地位。基本原理是通过一段与靶标 DNA 相同的 gRNA 指导 Cas9 核酸酶对靶向基因进行 DNA 修饰，以此造成基因的功能突变或缺失。在此基础上，利用 CRISPR/Cas9 技术建立哺乳动物全基因组突变库或者与某类功能相关的基因突变体库，通过功能性筛选和富集以及随后的 PCR 扩增和深度测序分析，发掘与筛选表型相关的基因，称为 CRISPR/Cas9 gRNA 文库筛选。gRNA 文库是药物筛选或靶向筛选特定通路的理想工具，gRNA 文库的建立将在功能基因筛选、疾病机制研究及药物研发等方面发挥重要的功能。

和元上海现有标准化的 GeCKO v2 human library 和 GeCKO v2 mouse library 两种全基因组文库，便于全基因组范围大规模筛选。除此，和元生物还提供 gRNA 文库定制服务，根据客户的需要专门设计特定信号通路的文库，比如疾病相关通路：抑癌基因、原癌基因、糖尿病基因、心血管疾病基因、帕金森病基因等；信号转导通路：RAS 信号通路、WNT 信号通路、JAK-STAT 信号通路、NF-KB 信号通路、TNF 信号通路、P13K-AKT 信号通路；细胞功能通路：自噬通路、细胞周期通路、凋亡通路等。另外，还可以根据客户课题特定的信号通路定制需求，设计 gRNA 进行个性化定制，客户只需提供相关的基因名称即可。

CRlSPR/Cas9 gRNA 文库筛选大体流程分为五步，即 gRNA 文库选择，gRNA 文库扩增，gRNA 文库慢病毒包装，gRNA 文库筛选，PCR 扩增和 NGS 测序。

1、gRNA 文库选择

首先客户需求选择所需 gRNA 文库。如果客户根据具体需要提出文库定制（小于 300 个基因），我们将根据客户提供的基因群信息进行单个基因的 gRNA 设计，保证每个基因设计 3 个不同的 gRNA，最大程度确保基因功能的突变。我们采用的载体是单/双慢病毒载体，单慢病毒载体是一个载体上同时携带单个 gRNA 和 cas9 基因，双慢病毒载体是一个载体上只有单个 gRNA，cas9 蛋白则由单独携带 cas9 的载体提供。这两种模式载体均携带有额外的抗性筛选标记。

2、gRNA 文库扩增

上述构建的载体数量较少，不足以进行文库的慢病毒包装和使用。因此，需要对上述载体进行扩增，增加总量。载体构建完成后，我们将这些载体按相同的比例混合成一个 pool（即载体混合库），随后将载体混合库使用专用电转感受态，电转扩增培养并收集菌落，并进行扩大培养，最后抽提质粒，即得到了扩增后的载体混合库，也就是文库。

3、gRNA 文库慢病毒包装

扩增后的 gRNA 文库在慢病毒包装载体的辅助下转染 293T 细胞，进行慢病毒的包装。由于 gRNA 文库是由多个不同的 gRNA 载体混合而成，因此我们获得的慢病毒是混合型病毒库，每个病毒携带单个 gRNA 载体。

4、gRNA 文库筛选

对筛选的目的细胞进行病毒感染预实验，得到细胞在较低的 MOI 时感染百分数，以确认感染时 gRNA 文库的病毒用量。慢病毒库以较低的 MOI 值感染细胞（确保每个细胞最多进入一个慢病毒），随后根据实验目的而对细胞采用相应的处理，最后经过不同的筛选方式富集细胞。以耐药性基因筛选实验为例，根据前期药物 IC50 实验，得到药物筛选实验的处理浓度。采用高浓度药物处理感染后的细胞，经过筛选后存活的细胞则具有一定的耐药性，将此群细胞扩增并收集下来，耐药性的来源是 CRlSPR/Cas9 gRNA 对相应基因的修饰。

5、PCR 扩增和 NGS 测序

对步骤 4 筛选中富集下来的细胞进行慢病毒载体的 PCR 扩增，该扩增片段包含载体所携带的 gRNA 序列，通过后续的 NGS 测序，我们可以得到富集细胞中 gRNA 的富集度，从而寻找到相应的基因，这些基因很有可能参与药物作用过程，因此可作为深入研究的待选基因。

实验流程如下：

gRNA 文库类型：

● 全基因组 gRNA 文库，可以敲除 19050 个表达基因和 1864 个 miRNA：
1) 敲除文库，human，慢病毒单病毒，19,050 genes+1,864 miRNAs；
2) 敲除文库，mouse，慢病毒单病毒，20,611 genes+1,175 miRNAs；
3) 敲除文库，human，慢病毒双病毒，1,880 unknown function genes。

● 定制 gRNA 文库，可根据通路中特定基因设计 gRNA：
1)   疾病相关基因：抑癌基因、原癌基因、糖尿病基因、心血管疾病基因、帕金森病基因等；
2)   信号转导通路：RAS 信号通路、WNT 信号通路、JAK-STAT 信号通路、NF-kB 信号通路、TNF 信号通路等；
3)   细胞功能相关：自噬、细胞周期、细胞凋亡、血管新生、肿瘤抑制等。

gRNA 文库筛选表型：

1)   肿瘤转移相关基因筛选（体内筛选）
2)   细胞迁移/侵袭相关基因筛选（体外筛选）
3)   细胞克隆形成相关基因筛选（体外筛选）
4)   细胞增殖相关基因筛选（体外筛选）
5)   肿瘤耐药相关基因筛选（体外筛选）
6)   细胞信号通路相关基因筛选（体外筛选）
7)   其他功能基因筛选，如自噬、细胞分化等

gRNA 文库应用领域：

1) 探索药物作用机制：药物靶点确定与验证
2) 寻找肿瘤治疗靶点：基因环路上下游调控机制分析
3) 探究代谢疾病治疗机制：代谢通路调节机制分析

我们的优势：

1)   产品全面：不仅拥有人类和小鼠的全基因组 gRNA 现货文库，而且可以定制任何类型的特定文库，后期更有活性文库即将推出！
2)   价格划算：现在订购 gRNA 文库享有一定折扣优惠，让您的实验经济、快速和高效地进行。
3)   种类多样：我们不仅可以使用单克隆形式构建 gRNA 载体，也可以使用芯片形式合成，确保最大的覆盖率。
4)   服务到位：我们除了可以提供 gRNA 文库质粒和病毒以外，还可以帮您进行下一步的筛选，最终提供目标基因名称。

编辑： z翟某某    来源：丁香园