不同培养基在猪伪狂犬病活疫苗生产中的应用研究
岑小清，房宜康，吴文福
（广东永顺生物制药有限公司，广州 510630）
摘要 本文利用猪伪狂犬病毒弱毒株Bartha-K61进行细胞培养，观察不同细胞培养基维持鸡胚成纤维细胞单层（CEF）生长情况，并测定病毒产量（TCID50 / ml）。结果在生产条件下，应用低血清培养基（MEM-SLM）添加0.5～2%新生犊牛血清，制备的维持液培养细胞单层生长良好，细胞间隙不明显，细胞形态正常。细胞单层接种病毒培养18-24小时左右，有少量细胞形成CPE，继续培养至48小时左右，70%以上细胞产生CPE，此时病毒增殖达到高峰，测定病毒产量达到2×10-6.75～2×10-7.5TCID50/ ml，符合猪伪狂犬病活疫苗制苗要求，实际应用低血清培养基制备的活疫苗可有效防制疫苗注射引起的过敏反应。
关键词 伪狂犬病；细胞培养；低血清培养基；活疫苗
猪伪狂犬病活疫苗的生产培养基采用人工合成培养基，需要添加新生犊牛血清，当添加量大于2%时，制备的活疫苗容易引起猪体严重的过敏反应。为了降低猪体过敏反应发生的几率，减轻过敏反应的程度，本试验对普通细胞培养基（BD-199）和清大天一低血清培养基（MEM-SLM）进行了应用比较研究，取得了在低血清培养条件下维持细胞良好产毒情况的试验结果，现报告如下。
1 材料
1.1 毒种 伪狂犬病毒Bartha-K61弱毒株冻干毒，由本公司王卓明研究员提供，本班组制成的细胞毒毒价可达到2×107.5TCID50/ml。
1.2 细胞培养溶液 包括7.5%碳酸氢纳溶液、20,000IU/ ml的青链双抗溶液、细胞生长液（乳汉氏液）和0.25%胰蛋白酶溶液，均自行配制。
1.3 细胞培养维持液 培养基BD-199粉购自广州合华科技有限公司， MEM-SLM粉购自清大天一公司，工作液由本班组配制并作过滤除菌。
1.4 新生犊牛血清 购自郑州佰安公司，无菌、无支原体及其它外源污染。
1.5 SPF种蛋购自北京梅里亚公司。
2 方法
2.1鸡胚成纤维细胞单层（CEF）的制备 SPF种蛋孵化至10天龄，按照“兽用生物制品规程”的方法制成。
2.2接毒和收获 CEF培养24小时后长成致密的单层细胞，倒出生长液，接入0.3%～0.5%的PRVF1细胞毒，吸附40～60分钟，对照组（Ⅰ和Ⅱ）分别加入血清含量为2%及1%的BD-199培养基制备的维持液；试验组（Ⅰ和Ⅱ）分别加入血清含量为2%及0.5%MEM- SLM低血清培养基制备的维持液。均调整PH7.0左右，继续培养观察细胞生长状态及特异性细胞病变（CPE）形成，并进行详细记录。一般继续培养至48小时70%以上的细胞出现特异性细胞病变（CPE）时，摇下瓶壁上的细胞连同维持液，收集于无菌的玻璃瓶中，在-15℃以下冷冻保存作细胞毒液，同时抽样保存备用。
2.3 细胞毒液效价测定 用小方瓶鸡胚成纤维细胞（收获的前24小时制备）测定细胞毒液毒价，并以细胞半数感染量（TCID50）计算病毒滴度。
3 结果
3.1维持细胞生长状态比较 在维持液血清含量同为2%的条件下，培养18-20小时，对照组BD-199维持液培养的CEF单层细胞生长良好，细胞之间间隙很少，细胞形态正常。试验组
表1 不同培养基培养CEF细胞生长情况和病毒特异性CPE形成情况比较
| 组别 | 维持液种类 | 血清含量（%） | 细胞单层生长状态 | 病毒特异性CPE形成（18小时） | |
| 试验组 | Ⅰ | MEM SLM | 2% | 细胞单层生长状态优良，无可见细胞间隙，细胞形态良好 | 少量细胞形成CPE |
| Ⅱ | MEM SLM | 0.5% | 细胞单层生长良好，细胞间隙不明显，细胞形态正常 | 少量细胞形成CPE | |
| 对照组 | Ⅰ | BD-199 | 2% | 细胞单层生长良好，细胞之间间隙很少，形态正常 | 少量细胞形成CPE |
| Ⅱ | BD-199 | 1% | 细胞单层生长状态变差，形态瘦长，细胞间隙增大 | 少量细胞形成CPE | |
MEM-SLM维持液培养的单层细胞生长优良，细胞之间无可见间隙，细胞形态良好，（见表1）。
当对照组血清含量降至1%、试验组血清含量降至0.5%时，对照组单层细胞生长状态明显变差、形态变得瘦长、细胞之间间隙增大。这时试验组细胞单层生长状态变化不明显，细胞形态正常，细胞之间间隙增大不明显。
表2 不同培养基在猪伪狂犬病活疫苗生产中不同批次细胞毒液的TCID50/ ml比较
| 批次 | 维持液种类 | 维持液血清含量 | TCID50/ ml |
| 060713 | BD-199 | 2% | 2×10-7.0 |
| MEM-SLM | 2% | 2×10-7.25 | |
| 060728 | BD-199 | 2% | 2×10-7.25 |
| MEM-SLM | 2% | 2×10-7.5 | |
| 060811 | BD-199 | 2% | 2×10-7.25 |
| MEM-SLM | 2% | 2×10-7.25 | |
| 060818 | BD-199 | 2% | 2×10-7.0 |
| MEM-SLM | 2% | 2×10-7.25 | |
| 070503 | BD-199 | 1% | 2×10-6.5 |
| MEM-SLM | 0.5% | 2×10-7.0 | |
| 070510 | BD-199 | 1% | 2×10-6.75 |
| MEM-SLM | 0.5% | 2×10-7.25 | |
| 070523 | BD-199 | 1% | 2×10-6.25 |
| MEM-SLM | 0.5% | 2×10-6.75 | |
| 070530 | BD-199 | 1% | 2×10-6.5 |
| MEM-SLM | 0.5% | 2×10-7.0 |
3.2 细胞毒液的TCID50比较 在血清含量等于或低于2%的条件下，低血清培养基MEM-SLM对鸡胚成纤维细胞的维持生长作用略优于BD-199培养基。两种培养基在变动血清添加量的条件下维持细胞，都能在接毒后培养18小时左右开始产生CPE，培养48小时左右CPE达70%以上。
当血清添加量为2%时，BD-199 液与MEM SLM液培养的病毒滴度相近，且都能达到2×10-7.0以上。不同批次猪伪狂犬病活疫苗生产结果显示，BD-199培养液的血清添加量降到1%，MEM-SLM培养液的血清添加量降到0.5%时，前者培养的病毒滴度下降明显，后者下降幅度则较少（见表2）。
4 小结和讨论
本应用比较研究的结果说明，低血清培养基在猪伪狂犬病活疫苗生产中取得成功。采用BD-199维持液培养CEF繁殖伪狂犬病病毒，实验结果说明血清添加量一般不宜低于2%，才能达到所需要的病毒效价。而采用MEM-SLM维持液培养病毒，血清添加量可降至0.5%，培养液病毒效价仍然可以达到配苗标准。MEM-SLM培养基可完全取代BD-199培养基，用于大规模的伪狂犬病疫苗生产。本研究结果对于采用低血清培养基培养其它细胞，或者生产其它病毒细胞苗具有参考意义。
猪用的各种疫苗中含有病毒、犊牛血清、蔗糖脱脂乳保护剂、乳蛋白等多种抗原物质，也可能是致敏原，对于猪是异体蛋白，都可能在使用中存在过敏现象。从疫苗的安全角度考虑，配苗毒液血清含量越低，猪群的非特异性异源蛋白过敏反应率也越低。采用MEM-SLM培养液可有效降低疫苗的血清含量，从而大大地降低猪群过敏反应。这与实际应用的结果是一致的。
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