Vero细胞、BHK21细胞的低血清培养和高密度培养研究
潘迎，罗海春，陈文庆
（北京清大天一生物技术有限公司）
提要 1、采用无蛋白的低血清细胞培养基培养Vero细胞、BHK21细胞，细胞在低血清培养基中的生长，形态及增殖方面均优于加入10％新生牛血清的传统培养基，且目标产物表达率显著提高，如Vero细胞狂犬疫苗生产病毒滴度比传统培养方式提高0.4左右。2、采用新型3L三层转瓶结合低血清细胞培养基培养Vero细胞、BHK21细胞，细胞数量可增加200％。3、采用无蛋白的低血清细胞培养基用于Vero细胞反应器培养生产狂犬疫苗效果良好
关键词 低血清细胞培养基，3L三层转瓶，Vero细胞，BHK21细胞，疫苗，高密度细胞培养
动物细胞大规模培养广泛应用于抗体药物、基因治疗药物、人用疫苗、兽用疫苗以及基因工程药品等生物制品的生产1，目前主要采用最基础的合成细胞培养基（如199、MEM等）2，甚至天然培养基（如水解乳蛋白）加入10％左右新生牛血清，在转瓶中培养细胞。随着对生物制品安全性要求的不断提高，在生产过程中控制和减少动物来源成分已成为一种趋势3－4。
美国FDA和美国农业部已经严密控制在细胞培养中胎牛血清的使用，以降低动物血清可能携带的传染源对细胞系和制品带来的风险。
在我国，疫苗等生物制品处于快速发展时期，目前生产企业大多采取加大固定资产投资的方式，即新建车间、大批量添置转瓶机、加大转瓶容量等方式提高产能，这种方式在一定程度上限制了生产的发展，并可能造成社会资源的浪费。
本文介绍的Vero细胞、BHK21细胞低血清培养和高密度培养，用于人、兽疫苗（如狂犬疫苗、口蹄疫疫苗等）生产，可以大幅度降低新生牛血清使用量，提高生物制品安全性，明显降低细胞培养成本；结合新型3L三层转瓶的使用可以充分利用生产企业现有设备，大幅度提高细胞密度，提高企业生产能力，减少投资，降低企业成本。
1 材料与方法
1.1 材料：
细胞株：BHK21细胞（中国兽医药品监察所）、Vero细胞（中国药品生物制品检定所）
培养基及添加物：
MEM细胞培养基（产品代码：MD605，批号：050712）、MEM SLM低血清细胞培养基（产品代码：SLM120，批号：050818）（北京清大天一生物技术有限公司）
改良199（HB）细胞培养基（产品代码：MD502 批号：050823）、199 SLM低血清细胞培养基（产品代码：SLM110 批号：050818）、SXQ-1低血清细胞培养基（产品代码：SLM100）（北京清大天一生物技术有限公司）
新生牛血清（批号：20050404）（武汉三利生物技术有限公司）
培养容器： 普通3L转瓶、新型3L三层转瓶（上海谦海生物科技有限公司）
设备： ZP-1型3L瓶转瓶机（上海浦东冷冻干燥设备有限公司）、XDS实验室系列倒置显微镜（重庆光电仪器总公司）、细胞培养恒温箱（自制）
1.2 方法：
1.2.1将复苏的Vero及BHK21细胞在T75培养瓶中使用传统培养基（含10％新生牛血清）培养三代，然后接种于普通3L转瓶及新型3L三层转瓶，使用低血清培养基与传统培养基（含10％新生牛血清）37℃培养细胞。
1.2.2 复苏BHK21细胞，利用低血清培养基（含新生牛血清4％）每2日传代一次，连续传代，与传统培养基（含新生牛血清10％）对照。
1.2.3 Vero细胞在普通3L转瓶中使用低血清培养基与传统培养基培养，对比滴度。
1.2.4 Vero细胞在反应器中使用低血清培养基生产狂犬疫苗。
1.3 观察：
每日用倒置显微镜观察各组细胞形态及生长增殖情况。
2．结果
2.1 Vero细胞和BHK21细胞在普通转瓶中低血清培养和传统培养的比较
2.1.1 Vero细胞在普通转瓶中低血清培养和传统培养的比较
Vero细胞在普通转瓶中采用199 SLM培养基低血清培养和采用改良199（HB）添加10％新生牛血清的传统培养的比较结果见表2.1.1。其中199 SLM培养基为低血清199培养基，主要用于Vero等细胞的低血清培养；改良199（HB）培养基为高缓冲性能的199培养基。
标2.1.1 Vero细胞在普通转瓶中低血清培养和传统培养的比较
| 项目 | 改良199（HB） | 199 SLM | 199 SLM | 199 SLM |
| 血清量 | 10％ | 5％ | 3％ | 1％ |
| 接种细胞密度 | 5×104 | 5×104 | 5×104 | 5×104 |
| pH（接种时） | 7.0 | 7.0 | 7.0 | 7.0 |
| 细胞贴壁百分率（24h） | 80 | 80 | 85 | 90 |
| 细胞分裂百分率（24h） | 50 | 75 | 85 | 80 |
| 细胞长成单层时间（小时） | 72-84 | 68-72 | 68-72 | 68-72 |
| 换液次数 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 细胞形态 | 正常 | 正常 | 正常 | 正常 |
由于是递减降血清培养，对细胞有一个驯化过程，因此当血清量降到1％时，低血清培养基的贴壁率随着血清量的降低略有上升。低血清培养基的细胞分裂百分率明显优于改良199培养基，并且使用低血清培养基细胞长成单层的时间比改良199培养基短4至8小时。低血清培养基的细胞形态优于改良199培养基的细胞形态。
2.1.2 BHK21细胞在普通转瓶中低血清培养和传统培养的比较
MEM SLM低血清培养基与MEM 培养基添加10％新生牛血清培养BHK21细胞比较结果见表2.1.2。其中MEM SLM培养基为低血清MEM培养基，主要用于BHK21等细胞的低血清培养。
表2.1.2 BHK21细胞在普通转瓶中低血清培养和传统培养的比较
| 项目 | MEM | MEM SLM | MEM SLM |
| 血清量 | 10％ | 5％ | 3％ |
| 接种细胞密度 | 5×104 | 5×104 | 5×104 |
| pH（接种时） | 7.0 | 7.0 | 7.0 |
| 细胞贴壁百分率（24h） | 80 | 80 | 75 |
| 细胞分裂百分率（24h） | 60 | 75 | 70 |
| 细胞长成单层时间（小时） | 120 | 96-108 | 96-108 |
| 换液次数 | 1 | 1 | 1 |
| 细胞形态 | 正常 | 正常 | 正常 |
低血清培养基与MEM培养基的贴壁率及分裂百分率均无明显差异。低血清培养基细胞长成单层的时间比MEM培养基短12至24小时。低血清培养基的细胞形态优于MEM培养基。
2.2 Vero细胞和BHK21细胞在新型3L三层转瓶中低血清培养和传统培养的比较。
2.2.1 Vero细胞在新型3L三层转瓶中低血清培养和传统培养的比较
采用新型3L三层转瓶，结合199 SLM低血清培养基与改良199（HB）培养基添加10％新生牛血清培养Vero细胞比较结果见表2.2.1
表2.2.1 Vero细胞在新型3L三层转瓶中低血清培养和传统培养的比较
| 项目 | 改良199（HB） | 199 SLM | 199 SLM | 199 SLM |
| 血清量 | 10％ | 5％ | 3％ | 1％ |
| 接种细胞密度 | 5×104 | 5×104 | 5×104 | 5×104 |
| pH（接种时） | 7.0 | 7.0 | 7.0 | 7.0 |
| 细胞贴壁百分率（24h） | 95 | 95 | 95 | 90 |
| 细胞分裂百分率（24h） | 90 | 80 | 90 | 80 |
| 细胞长成单层时间（小时） | 120 | 96－108 | 96-108 | 120 |
| 换液次数 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 细胞形态 | 正常 | 正常 | 正常 | 正常 |
低血清培养基与改良199培养基在贴壁百分率及细胞分裂百分率上差异不大，而含3％血清及5％血清的低血清培养基细胞长成单层的时间较改良199培养基和含1％血清的低血清培养基短12-24小时。低血清培养基的细胞形态优于改良199培养基。
2.2.2 BHK21细胞在新型3L三层转瓶中低血清培养和传统培养的比较
采用新型3L三层转瓶，结合MEM SLM低血清培养基与MEM培养基添加10％新生牛血清培养BHK21细胞比较结果见表2.2.2
表2.2.2 BHK21细胞在新型3L三层转瓶中低血清培养和传统培养的比较
| 项目 | MEM | MEM SLM | MEM SLM |
| 血清量 | 10％ | 5％ | 3％ |
| 接种细胞密度 | 5×104 | 5×104 | 5×104 |
| pH (接种时) | 7.0 | 7.0 | 7.0 |
| 细胞贴壁百分率（24h） | 80 | 80 | 75 |
| 细胞分裂百分率（24h） | 60 | 60 | 60 |
| 细胞长成单层时间（小时） | 120 | 96-108 | 96-108 |
| 换液次数 | 2 | 2 | 2 |
| 细胞形态 | 正常 | 正常 | 正常 |
低血清培养基与MEM培养基的贴壁百分率及细胞分裂百分差异不大，低血清培养基比MEM培养基长成单层的时间短12～24小时。培养后期低血清培养基细胞形态优于MEM培养基细胞形态。
2.3 用低血清培养基结合使用新型3L三层转瓶培养Vero细胞和BHK21细胞与用传统培养基结合使用普通转瓶培养比较
单层转瓶内细胞贴壁为一个面，新型3L三层转瓶内细胞贴壁为五个面，三层转瓶的有效表面积约为单层转瓶的3.5倍。使用三层转瓶时细胞接种数量要适量增加，如不增加细胞接种数量则需增加换液次数。
2.3.1 Vero细胞在新型3L三层转瓶中低血清培养与普通3L转瓶中传统培养的生长比较
采用新型3L三层转瓶，结合199 SLM低血清培养基与普通3L转瓶结合改良199（HB）培养基添加10％新生牛血清培养Vero细胞比较结果见表2.3.1
表2.3.1 Vero细胞在新型3L三层转瓶中低血清培养与在普通3L转瓶中传统培养的比较
| 项目 | 改良199 (单) | 199 SLM (三) | 199 SLM (三) |
| 血清用量% | 10 | 5 | 3 |
| 液体量（ml） | 200 | 500 | 500 |
| pH（接种时） | 7.0 | 7.0 | 7.0 |
| 接种细胞密度 | 5×104 | 5×104 | 5×104 |
| 细胞长成单层天数 | 3 | 4～5 | 4～5 |
| 换液次数 | 1 | 2 | 2 |
| 长成致密单层时细胞数量 | 3×108 | 9×108 | 9×108 |
在相同的细胞接种密度的情况下，低血清培养基在三层瓶中的液体量是改良199培养基的2.5倍，细胞长成单层的天数是改良199培养基的1.5倍左右。但是血清量可以降低70％，而细胞量增加3倍左右。如在三层瓶中提高细胞接种密度可缩短细胞长成单层的时间。
2.3.2 BHK21细胞在新型3L三层转瓶中低血清培养与普通3L转瓶中传统培养的生长比较
采用新型3L三层转瓶，结合MEM SLM低血清培养基与普通3L转瓶结合MEM培养基添加10％新生牛血清培养BHK21细胞比较结果见表2.3.2
表2.3.2 BHK21细胞在新型3L三层转瓶中低血清培养与在普通3L转瓶中传统培养的比较
| 项目 | MEM(单) | MEM SLM (三) | MEM SLM（三） |
| 血清用量% | 10 | 5 | 3 |
| 液体量（ml） | 200 | 500 | 500 |
| pH (接种时) | 7.0 | 7.0 | 7.0 |
| 接种细胞密度 | 5×104 | 5×104 | 5×104 |
| 细胞长成单层天数 | 3 | 4-5 | 4-5 |
| 换液次数 | 1 | 2 | 2 |
| 长成致密单层时细胞数量 | 3×108 | 9×108 | 9×108 |
| 细胞形态 | 正常 | 正常 | 正常 |
在相同的细胞接种密度的情况下，低血清培养基在三层瓶中的液体量是MEM培养基的2.5倍，细胞长成单层的天数是MEM培养基的1.5倍左右。但是血清量可以降低70％，而细胞量增加3倍左右。如在三层瓶中提高细胞接种密度可缩短细胞长成单层的时间。
2.4 低血清培养基用于BHK21细胞的传代试验，除培养基种类和新生牛血清添加量区别外，试验条件方法完全一致。
表2.4.1 MEM SLM低血清培养基与MEM培养基用于BHK21细胞的传代比较
| 项目 | 细胞培养基 | 新生牛血清添加量 | 1—5代 （方瓶） | 6－8代 （转瓶） | 9－12代 （转瓶） | 13代以后 （转瓶） |
| 低血清组 | MEM SLM低血清培养基 | 4％ | 细胞形态及致密度均优于对照组 | 细胞形态及致密度均优于对照组 | 无明显差异 | 有部分老化脱落 |
| 对照组 | 基础MEM | 10％ | 正常 | 无明显差异 | 正常 | |
低血清培养基与对照培养基所传代细胞留作种细胞均可1：5连续传代。
低血清培养基营养成分优于基础培养基，易使细胞增殖迅速，代谢旺盛，代谢产物对细胞有不良影响，易产生细胞老化脱落现象。因此需要适当增加换液次数，增加传代频率。
2.5 低血清培养基用于Vero细胞狂犬疫苗的毒力试验。
某狂犬疫苗生产企业采用普通3L转瓶生产狂犬疫苗情况见表2.5.1
表2.5.1 199 SLM培养基与199（改良HB）培养基用于Vero细胞狂犬疫苗滴度比较
| 细胞培养基 | 新生牛血清添加量 | １次苗滴度 | 2次苗滴度 | 平均滴度 |
| 199 SLM-1 | 5％ | 7.066 | 6.820 | 6.943 |
| 199 SLM-7 | 5％ | 6.986 | 6.866 | 6.926 |
| 199（HB） | 10％ | 6.661 | 6.402 | 6.532 |
2.6 低血清培养基用于反应器Vero细胞狂犬疫苗的生产5
某狂犬疫苗生产企业采用NBS反应器生产狂犬疫苗情况见表2.5.1
表2.6.1 低血清培养基用于反应器Vero细胞狂犬疫苗生产的情况
| 细胞培养基 | 细胞扩增中新生牛血清添加量 | 病毒滴度 |
| SXQ-1 | 5％ | ≥8.5 |
3．讨论：
3.1 采用199 SLM和MEM SLM低血清培养基分别培养Vero细胞、BHK21细胞，新生牛血清用量可以从10％降至3％，减少新生牛血清使用批次和批间差的影响，减少生物制品纯化损失，减少由于不确定蛋白或者其它血清组分带来干扰和差异的风险，提高制品安全性。低血清培养基可以在方瓶、3L转瓶、15L转瓶及生物反应器中培养细胞，在疫苗生产中可以达到低血清高密度的培养效果。
低血清培养基营养成分优于基础培养基，易使细胞增殖迅速，代谢旺盛，代谢产物对细胞有不良影响，易产生细胞老化脱落现象。因此需要适当增加换液次数，增加传代频率。获取同样的细胞量，用低血清培养基将比用传统培养基缩短近1/3的时间，可提高生产效率。
采用新型3L三层转瓶配合低血清培养基培养细胞，细胞量是普通转瓶的3倍左右。3L三层转瓶培养时培养基利用率较高，可相对降低培养液成本，细胞收获方法与单层转瓶相同，可以降低劳动强度，因此可充分利用现有的设备（转瓶机），大幅度提高细胞量，从而提高疫苗产量质量，减少固定资产投资，大大降低制品综合成本,提高效益。
3.2 采用199 SLM低血清培养基培养Vero细胞分泌狂犬疫苗病毒，滴度明显高于采用199培养基传统培养获得的滴度。
3.3 采用MEM SLM低血清培养基BHK21细胞，在本实验情况下12代内细胞形态和致密度均优于MEM培养基传统培养情况，因而可以预期其产生的口蹄疫、甲肝等疫苗生产的病毒产量将提高。
低血清培养基结合3L三层转瓶培养细胞还未接毒进行滴度测试，有待进一步研究。
3.4低血清培养基用于反应器Vero细胞狂犬疫苗的生产，实践证明效果良好。
综上所述，在生物制品生产中，系统、全面的研究动物细胞培养技术，不断追求最佳的细胞培养技术，大规模高密度低血清动物细胞培养可以有效的提高生产效率，有效地提高安全性，有效降低生物制品成本，提高利润率，增强产品市场竞争力。
参考文献：
林福玉，陈昭烈等. 大规模动物细胞培养的问题及对策[J]. 生物技术通报，2004.
张卓然. 实用细胞培养技术[M]. 人民卫生出版社.
薛庆善. 体外培养的原理与技术[M]. 科学出版社.
鄂征. 组织培养和分子细胞学技术[M]. 北京出版社.
孙文，毕军等. 50L生物反应器培养基狂犬病毒工艺研究[J]. 第八次全国生物制品学术会议论文汇编.
默克密理博北京清大天一细胞培养基的研发、制造适应了疫苗、抗体药物行业的技术发展需要和生产需要，细胞培养基产品和业务包括无血清培养基、低血清培养基、反应器悬浮培养基等个性化细胞培养基，基础细胞培养基，以及客户定制细胞培养基服务。