蛋白表达-破菌操作程序

1、仪器及试剂

试剂： LB 培养基、1*PBS、IPTG、巯基乙醇（或 DTT）、8M 尿素、3*SDS 上样缓冲液、12% 分离胶、5% 浓缩胶、10% 过硫酸铵、TEMED、1*SDS-PAGE 电泳缓冲液、乙醇、乙酸、考马斯亮蓝（R250）

仪器：灭菌锅、无菌操作台、移液器、恒温摇床、分光光度计、高速离心机、超声波破菌机、电泳槽、电泳仪、脱色摇床、凝胶成像系统

2、诱导：

取出灭菌的 LB 培养基（300 ml）加入对应抗生素，取出 2 ml 放入比色皿中，作为标准溶液。
将上述已有表达的菌液加入 LB 培养基中，恒温摇床 37 摄氏度 3-4 小时测 OD 值，当 OD 值到达 0.5-0.6 之间时加入 IPTG 诱导（300μl）3-4 小时。
将菌液倒入离心瓶中离心（3900 转/min 10 min）弃上清液。
需要过夜保存时将离心好的菌液放于 -20 度冰柜。

3、破菌：

取 50 ml 的 1×PBS，悬浮菌体。加入 50μl 巯基乙醇（还原作用，防止细胞氧化）.
选择好合适的变幅杆，功率 400W，破菌时间 3S，间隔时间 3S，共 10 min，超声破菌（菌液置于冰块中）。离心（9000 转/min）10 min 得到上清液①和沉淀，上清①装于 50 ml 离心管中，暂时放 4 度保存。
沉淀先用去离子水小心洗 2 边包括管壁，称取 6 g 尿素用 1×PBS 溶解定容到 44 ml，倒入沉淀中，吹匀沉淀，倒入 50 ml 的烧杯中，功率 400W，破菌时间 3S，间隔时间 3S，共 5 min 破菌（菌液置于冰块中），离心（9000 转/min）10 min 得到上清液 ② 和包涵体，上清 ① 装于 50 ml 离心管中，暂时放 4 度保存。
沉淀先用去离子水小心洗 2 边包括管壁，包涵体加入 6 ml ddH₂O，悬浮后平均分装到 4 个 2 ml 的离心管中，离心（12000 转/min）2 min。弃上清。选取其中一管加入 1.5 ml 8M 的尿素，溶解、离心（12000 转/min）1 min 上清移入到新的 2 ml 离心管中。

4、SDS-PAGE 电泳确定蛋白表达位置及纯度：

将得到的上清液①上清液② 包涵体做 10 倍稀释和 50 倍稀释电泳，染色、脱色后确定蛋白表达的位置, 上清则需要经过标签纯化，如不在上清，及时处理掉放于 4 度冰箱的上清。如在包涵体且纯度达到要求 90% 以上，则将包涵体保存在指定的盒子中，放-20 度保存。

注意事项：

诱导时菌体浓度，OD 值范围 0.5-0.6；
根据第一次破菌之后沉淀多少决定是否需要第二次破菌；
避免连续超声导致大量产热，可分成短时间、多次超声；
如果表达载体的原核启动子为 PL 启动子，则在 30 -32 培养数小时，使培养液的 OD600 达 0.4-0.6，迅速使温度升至 42 继续培养 3 -5 h；如果表达载体的原核启动子为 tac 等，则 37 ℃ 培养细菌数小时达到对数生长期后加 IPTG 至终浓度为 1 mmol / L。继续培养 3-5 小时。

编辑： zhuq 来源：丁香园