分子克隆操作程序

实验试剂及仪器

试剂：质粒 DNA 小量试剂盒，DNA 凝胶回收试剂盒，DNA 产物回收试剂盒，DNA 产物回收试剂盒，Pfu，DNA marker，感受态 DH5α， BamHI 酶，XhoI 酶，EcoRI 酶，T4 DNA ligase

实验仪器： PCR 仪， 离心机，凝胶成像系统：Tanon 2500，天能公司 

耗材：实验中所用到的 PCR 管，枪头

试验步骤

1、引物的稀释

引物一般以干粉形式保存于-20℃，临用前稀释。

由于引物呈很轻的干膜状附在管壁上，打开时极易散失，所以打开管子前请先离心10,000 rpm,1 min, 然后再慢慢打开管盖。然后在装有引物的管内根据引物说明书加入双蒸水稀释至 10μM，盖上管盖，充分上下振荡 30 秒，再次离心，小离心机 30 秒 (管上标注好引物名称、浓度、稀释时间)

2、PCR 扩增反应体系

在 0.2 ml 离心管中加入以下成分：

（做多管的时候可以把除引物模板以外的组分混合后分装）

轻弹混匀，离心收集管壁上的液滴至管底, 在 PCR 扩增仪上进行 PCR 反应，反应参数如下（不同基因的退火温度以及延伸时间略有差异, 退火温度为引物 Tm 上下 5℃）

反应结束后，取2μ_l  PCR产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳，并以 DNA Marker 6u_l 做对照。120V恒压条件下电泳 20 min 后，于凝胶成像系统下观察并将电泳图贴到记录本中（扩增产物大约30ng/μ_l）

3、PCR 产物的回收

如果扩增产物条带单一用 Axygen AP-PCR-250 纯化 PCR 产物，具体操作按试剂盒说明书进行（回收产物用 35u_l ddH₂O 洗脱两遍）

如果出现非特异性扩增，目的产物用 AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒回收（AP-GX-250），具体操作按试剂盒说明书进行（回收产物用 35u_l ddH₂O 洗脱两遍）

4、目的产物及载体酶切

目的产物酶切（在 1.5 ml 离心管中加入以下成分, 以 BamHI 和 XhoI 为例）

振荡混匀，短暂离心；

载体酶切（载体使用中抽质粒试剂盒）

37℃ 温育 过夜；80℃ 水浴 20 min 终止反应

5、酶切产物回收

酶切产物用 DNA 产物回收试剂盒回收，具体操作按试剂盒说明书进行（目的产物酶切用 35u_l ddH₂O 洗脱两遍，载体酶切用 50u_l ddH₂O 洗脱两遍），将电泳图贴到记录本中。

6、目的片段与载体连接

振荡混匀，短暂离心。16℃ 连接过夜；65℃ 灭活 10 min

(加入载体的量（ng）× 插入片段大小（Kb）)/载体大小（Kb）× 插入片段和载体的摩尔比= 插入片段的量

7、转化（感受态 DH5α）

将 100 ml 感受态 分为两管进行转化，具体步骤按照说明书进行。

8、挑菌鉴定阳性克隆

每个平板挑三个单克隆，分别培养在装有 2 ml LB 培养基的试管中，150 rpm 培养过夜。或培养在装有 1 ml LB 培养基的试管中 ，180 rpm 培养 4～5 小时 ，进行 PCR 鉴定。

轻弹混匀，瞬时离心收集管壁上的液滴至管底, 在 PCR 扩增仪上进行 PCR 反应，反应参数如下

反应结束后，取 2u_l PCR 产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳，并以 DNA Marker 6u_l 做对照。120V恒压条件下电泳 20 min 后，于凝胶成像系统下观察是否含有目的条带, 保存图片并且贴于笔记本中。

选择一个阳性克隆菌液（200u_l）送测序，其余的阳性克隆菌液保存于 4℃，待测序结果出来后处理（测序结果正确，菌液丢弃；不正确，补送其他样品测序）

如果插入片段大于 900，正反测序；小于 900，P3 载体反向测序（T7 ter 引物）；pGEX-4T载体 插入片段离正向引物较近，选择反向测序（pGEX-R），对比测序结果，做好记录。

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编辑： zhuq    来源：丁香园