关键词: DNA 测序原理 方法
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【计算】
测序反应精确度计算公式:100%-差异碱基数(不包括N数)/650×100% 差异碱基即测定的DNA序列与已知标准DNA序列比较不同的碱基,N为仪器不能辨读的碱基。
【注意事项与评价】
1.ABI PRISM 310基因分析仪是高档精密仪器,需专人操作、管理和维护。
2.本实验测序PCR反应的总体积是5μl,而且未加矿物油覆盖,所以PCR管盖的密封性很重要,除加完试剂后盖紧PCR管盖外,最好选用PE公司的PCR管。如PCR结束后PCR液小于4~4.5μl,则此PCR反应可能失败,不必进行纯化和上样。
3.作为测序用户来说,只需提供纯化好的DNA样品和引物,一个测序PCR反应使用的模板不同,需要的DNA量也就不同,PCR测序所需模板的量较少,一般PCR产物需30~90ng,单链DNA需50~100ng,双链DNA需200~500ng,DNA的纯度一般是A260nm/A280nm为1.6~2.0,最好用去离子水或三蒸水溶解DNA,不用TE缓冲液溶解。引物用去离子水或三蒸水配成3.2pmol/μl较好。
4.本实验使用的测序试剂盒是BigDye荧光标记终止底物循环测序试剂盒,一般可测DNA长度为650bp左右。本仪器DNA测序精确度为(98.5±0.5) %,仪器不能辨读的碱基N<2%,所需测定的长度超过了650bp,则需设计另外的引物。为保证测序更为准确,可设计反向引物对同一模板进行测序,相互印证。对于N碱基可进行人工核对,有时可以辨读出来。为提高测序的精确度,根据星号提示位置,可人工分析该处彩色图谱,对该处碱基作进一步核对。
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