关键词: 感受态细胞 重组 转化 克隆
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4.操作步骤
1)大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法) (1) 从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落,接种于3~5ml LB液体培养中,37℃振荡培养12h左右,直至对数生长期。将该菌悬液以1:100~1:50转接于100ml LB液体培养基中,37℃振荡扩大培养,当培养液开始出现混浊后,每隔20~30min测一次OD600nm,至OD600nm≤0.5时停止培养; (2) 每组取培养液3个2ml转入2ml离心管中,在冰上冷却20-30min,于4℃,4000r/min离心10min(从这一步开始,所有操作均在冰上进行,速度尽量快而稳); (3) 倒净上清培养液,用1ml冰冷的0.1mo1/L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰浴; (4) 0~4℃,4000r/min离心10min; (5) 弃去上清液,加入500µll冰冷的0.1mo1/L CaCl2溶液,小心悬浮细胞。0~4℃,4000r/min离心10min; (6) 弃去上清液,加入100µl冰冷的0.1mo1/L CaCl2溶液,小心悬浮细胞,冰上放置片刻后,即制成了感受态细胞悬液; (7) 制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验,也可加入占总体积15%左右高压灭菌过的甘油,混匀后分装于1.5ml离心管中,置于-70℃条件下,可保存半年至一年。
2)细胞转化 (1) 分别取3个100µl感受态细胞悬液(如是冷冻保存液,则需化冻后马上进行下面的操作),第一组,加入10 µl重组质粒DNA(体积不超过10µl) 100µl感受态细胞,此管为转化实验组。第二组,插入DNA片段对照组,即酶切后DNA片段25ng 100µl感受态细胞悬液;第三组,质粒DNA对照组,即1ng 未酶切pBluescript 质粒DNA十100µl感受态细胞悬液。 (2) 将以上各样品轻轻摇匀,冰上放置20-30min,于42℃水浴中保温1-2min,然后迅速冰上冷却2min (3) 立即向上述管中分别加入0.4ml LB液体培养基(不需在冰上操作),使总体积到0.5ml,该溶液称为转化反应原液,摇匀后于37℃振荡培养约45-60min ,使受体菌恢复正常生长状态,并使转化体表达抗生素基因产物(Ampr)。
3) 平板培养(有时需要稀释) (1) 取各样品培养液0.1ml,分别接种于含抗菌素LB平板培养基上,涂匀(如果用玻璃棒涂抹,酒精灯烧过后稍微凉一下再用,不要过烫)。 (2) 菌液完全被培养基吸收后,倒置培养皿,于37℃恒温培养箱内培养过夜(12-16小时),待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养,对于可以蓝白斑筛选的质粒和菌株来说,此时应该能清楚地看到蓝色和白色菌落。
用 CaCl2法制备的感受态细胞,可使每微克超螺旋质粒 DNA产生5×106-2×107个转化菌落。在实际工作中,每微克有105以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验。
4) 检出转化体和计算转化率 统计每个培养皿中的菌落数,各实验组培养皿内菌落生长状况应如表所示: 各实验组在培养皿内菌落生长状况及结果分析
转化体总数=菌落数×(转化反应原液总体积/涂板菌液体积) 插入频率=蓝色菌落数/白色菌落数 转化频率=转化体总数/加入质粒DNA的量(计算出每微克的转化菌落数)
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小树洞:你们工作后第一个月都得了多少工资呢?
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