Western Blot 云学堂

为了帮助大家顺利且有效率的完成实验,丁香学社联合众多知名企业整理了WB 标准操作流程,注意事项和相关解决方案,帮助大家轻松获得可靠、线性、定量的实验结果。

实验资料

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蛋白质的蛋白质的提取技术

选择材料及预处理   以蛋白质和结构与功能为基础,从分子水平上认识生命现象,已经成为现代生物学发展的主要方向,研究蛋白质,首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识,但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别,把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中,如盐析,有机溶剂提取,层析和结晶等;二是将混合物置于单一物相中,通过物理力 ...
来源:互联网
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蛋白质技术之“蛋白质的浓缩”

本文主要介绍了蛋白质浓缩的分析方法和制备方法。
来源:互联网
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WB (western blot)-经验汇总

做了很久的 WB(western blot),走了很多弯路,其实发现 WB 想要做好并不难,总结了 WB 实验中可能会遇到的问题,分析了可能的原因及对应的解决方案,希望能成为你实验成功的基石。问题 1:转膜不充分(1) 膜没有完全均匀湿透使用 100% methanol 浸透膜。(2) 靶蛋白分子量小于 10 000选择小孔径的膜,缩短转移时间。(3) 靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液 pH 值可尝试使用其他缓冲液如 CAPS 缓冲液(pH 10.5) 或使用低 pH 值缓冲液如乙酸缓冲液。(4) 甲醇浓度过高过高 ...
来源:生物学霸
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WB实战指南(一) 之样品制备

一、样品制备:1、变性条件——SDS LB直接裂解:用常温或者高温预热过(预热更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化,但容易遗忘,LB久煮某些性质会改变)的1*SDS LB(或者略高1.5*)直接加到细胞或者组织上并煮样。通常6孔板细胞80%以上密度,需200ul,其他按平板面积比类推。通常条件下,SDS LB都是过量的(因此不一定要严格参考SDS LB稀释比);如果SDS LB不够,样品核酸、蛋白浓度过高时,煮样后会发现tip吸不上来,非常粘 ...
来源:丁香园
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WB实战指南(二) 之 蛋白质电泳

蛋白电泳:电泳胶的制备、配方、缓冲液配方,请参考分子克隆。经验之谈,8%胶最底边约36KDa,10%最底边约25KDa,12%最底部约12KDa。8%胶可以跑300KDa-36KDa之间的任意蛋白,转膜效率对WB结果的的影响都问题不大。12%,180KDa左右,转膜效率对WB结果的影响都问题不大(300KDa蛋白如何,没有尝试过)。电泳一般采用恒流,45mA-55mA(应根据电泳仪器适当调整,要注意仪器最高限压;此条件适合g ...
来源:丁香园
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WB实战指南(三) 之 转印

转印——转印效率对WB结果的影响并不如书本和网络上宣扬的那么大!首先必须澄清的是,很多时候新手会把WB结果无信号归咎于转膜不够充分,实际上转膜效率对最终结果的影响所占比重并不高,真正取决定性因素的是抗体识别能力的强弱,以及如何正确使用抗体,这个问题下节讨论。有一个简单的例证,Biorad提供的3mm厚滤纸初次使用时,通常转膜效果不理想(从预染的marker深浅可知),但对多数一般丰度的蛋白的检测没有任何影响(建 ...
来源:丁香园
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