选择材料及预处理 　　以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力 ...

本文主要介绍了蛋白质浓缩的分析方法和制备方法。

做了很久的 WB（western blot），走了很多弯路，其实发现 WB 想要做好并不难，总结了 WB 实验中可能会遇到的问题，分析了可能的原因及对应的解决方案，希望能成为你实验成功的基石。问题 1：转膜不充分(1) 膜没有完全均匀湿透使用 100% methanol 浸透膜。(2) 靶蛋白分子量小于 10 000选择小孔径的膜，缩短转移时间。(3) 靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液 pH 值可尝试使用其他缓冲液如 CAPS 缓冲液（pH 10.5) 或使用低 pH 值缓冲液如乙酸缓冲液。(4) 甲醇浓度过高过高 ...

一、样品制备：1、变性条件——SDS LB直接裂解：用常温或者高温预热过（预热更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化，但容易遗忘，LB久煮某些性质会改变）的1*SDS LB（或者略高1.5*）直接加到细胞或者组织上并煮样。通常6孔板细胞80%以上密度，需200ul，其他按平板面积比类推。通常条件下，SDS LB都是过量的（因此不一定要严格参考SDS LB稀释比）；如果SDS LB不够，样品核酸、蛋白浓度过高时，煮样后会发现tip吸不上来，非常粘 ...

蛋白电泳：电泳胶的制备、配方、缓冲液配方，请参考分子克隆。经验之谈，8%胶最底边约36KDa，10%最底边约25KDa，12%最底部约12KDa。8%胶可以跑300KDa-36KDa之间的任意蛋白，转膜效率对WB结果的的影响都问题不大。12%，180KDa左右，转膜效率对WB结果的影响都问题不大（300KDa蛋白如何，没有尝试过）。电泳一般采用恒流，45mA-55mA（应根据电泳仪器适当调整，要注意仪器最高限压；此条件适合g ...

转印——转印效率对WB结果的影响并不如书本和网络上宣扬的那么大！首先必须澄清的是，很多时候新手会把WB结果无信号归咎于转膜不够充分，实际上转膜效率对最终结果的影响所占比重并不高，真正取决定性因素的是抗体识别能力的强弱，以及如何正确使用抗体，这个问题下节讨论。有一个简单的例证，Biorad提供的3mm厚滤纸初次使用时，通常转膜效果不理想（从预染的marker深浅可知），但对多数一般丰度的蛋白的检测没有任何影响（建 ...