如何在组织原位更精确的对单细胞进行识别与定量分析,是生命科学领域经久不衰讨论的话题之一。利用流式细胞术在液流中收集的单细胞数据,仅粗略的包含了细胞大小,但无法获得其在组织原位的形态、细胞间的结构以及目标在组织水平空间分布的信息,同时也无法在短时间内收集、分析千万级别数量的细胞定量结果,更无法在大数据量样本在大空间尺度上的表达模式进行探索性研究。

TissueGnostics 公司利用完全自动化的全景组织细胞扫描系统,可以建立包含上千万细胞信息的多张虚拟切片样本,结合了流式细胞术中利用二维散点图进行细胞筛选分群的信息架构方法,不但可以获得组织原位分子结构、细胞结构、组织结构的定量信息,还可以对其在空间位置上的互相关系信息进行数字化定量,并在大数据水平进行模式分析。

技术应用

1.肿瘤细胞迁移能力定量分析

细胞间粘附性降低以及癌细胞穿过基底膜、降解细胞外基质能力的获得均与癌细胞肌动蛋白微丝骨架的聚合、解聚及重排失控有关。癌细胞胞质骨架系统发育不良, 骨架纤维细碎, 排列无规则; 而正常细胞胞质骨架发达, 富有应力纤维束。细胞骨架可能是其恶性行为的形态学基础之一。

在肿瘤细胞转移中,存在类似于片状伪足的一些特殊的细胞膜突起, 称侵入性伪足。其中富含肌动蛋白调节蛋白、粘附分子、信号/受体蛋白、细胞膜重组蛋白及基质蛋白水解酶等, 可以重构和降解细胞外基质, 是肿瘤细胞侵袭转移的重要结构。

肌动蛋白微丝是指直径 7nm 左右、主要由进化上极度保守的肌动蛋白组成的细胞内螺旋状、有极性的细纤维组成, 是细胞骨架的主要成分。癌细胞在迁移过程中不仅可以改变自身黏附能力,还能调节细胞骨架及膜突出获取迁移和侵袭的性能。

TissueGnostics 公司提供的肿瘤细胞的胞质骨架分析方案,通过对细胞胞质内染色标记物进行特异性位置分析,以及对细胞骨架纤维、肌动蛋白微丝、黏着斑等结构进行识别后,对其数量、染色强度、长度、分布等进行定量分析,使从细胞到组织水平,利用统一方法对肿瘤迁移能力进行分析成为可能。

2.H&E 染色细胞/组织区域识别

HE 染色(苏木精-伊红染色)是组织学最常用的染色方法之一。这种染色方法的基础是组织结构对不同染料的结合程度不同。染料苏木精可以将嗜碱性结构染成蓝紫色,而伊红可以将嗜酸性结构染成粉红色。针对不同的样本类型,一般来说,细胞核可以被苏木精染成鲜明的蓝色。细胞质被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色。胶原纤维呈淡粉红色,弹力纤维呈亮粉红色,红血球呈橘红色,蛋白性液体呈粉红色。着色情况与组织或细胞的种类有关,也随其生活周期及病理变化而改变。

病理组织 HE 染色的特点具有操作快捷简单的特点,但是同样会丢失组织细节,以及无法获得特异性目标分子/蛋白的表达信息,以往针对特异性颜色进行识别定量的软件往往无法对 HE 染色样本进行很好的分析。

TissueGnostics 公司在独立苏木精染色通道的基础上, 利用专利算法对细胞核进行识别,并利用散点图设门圈选的方式,综合不同组织结构伊红染色中的细微差异,可以做到在 HE 染色样本中更多数据的挖掘。

HE 染色组织区域识别解决方案,可以自动独立拆分苏木精染色通道与伊红染色通道,在苏木精染色通道内对细胞核进行精准识别,对苏木精着色面积与强度进行筛选后,识别出正常细胞/肿瘤细胞/炎性淋巴细胞;进一步可以根据细胞核形态与密度,以及伊红染色情况,对肿瘤/血管/胶原纤维/蛋白渗出液等组织区域进行识别定量分析。该解决方案可以在 H&E 染色样本中挖掘更多的数据信息,使大批量样本简单染色+深度分析成为可能。

3.特异性神经元量化分析

神经元又名神经细胞,是神经系统的结构与功能单位之一。神经元能感知环境的变化,再将信息传递给其他的神经元,并指令集体做出反应。神经元占了神经系统约 10%,其他大部分由神经胶质细胞所构成。

神经元结构上大致可分为细胞体和神经突两部分。神经突又分树突和轴突两种。轴突往往很长,由细胞的轴丘分出,其直径均匀,开始一段称为始段,离开细胞体若干距离后开始获得髓鞘,成为神经纤维。神经信号传递形成电流,在其尾端为受体,借由化学物质传导,在适当的量传递后在两个突触间形成电流传导。

针对神经元细胞的胞体与突起识别,常见的解决方案是针对不同结构进行特异性染色,再根据不同染色区分不同的细胞结构,这样往往也会造成样本在制备过程中操作复杂,多种染色结构也会造成非特异性染色增多,增加定量分析的难度。

TissueGnostics 公司提供的特异性神经元量化分析方案,利用形态学定量识别的方法,从单一 IHC 染色样本中识别神经元胞体和突起,解决了上述问题。按照 不同功能、不同区域的神经元外型有所差异,在免疫组化样本中,不依靠特异性染色区分神经元胞体和神经突触,对其大小、长度、分支数量进行识别定量,并根据不同功能与不同区域,区分单极/多级神经元。通过对神经元胞体及神经突起的空间位置信息,使不同神经元突起之间接触数量的定量分析成为可能。

4.肿瘤微环境分子互作量化分析

肿瘤微环境是指肿瘤细胞存在的周围微环境,包括周围的腺体、血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓源性炎性细胞、各种信号分子和细胞外基质。肿瘤和周围环境密切相关,不断进行交互作用,肿瘤可以通过释放细胞信号分子影响其微环境,促进肿瘤的血管生成和诱导免疫耐受,而微环境中的免疫细胞可影响癌细胞增长和发育,有助于肿瘤异质性的形成,肿瘤微环境中的免疫细胞组成常常会决定其对某种特定疗法的响应,尤其是会决定癌症免疫疗法的成败。

结合特异性染色,TissueGnostics 公司提供肿瘤微环境中目标细胞在组织原位空间位置的量化分析。在图示案例中,解决方案的内容包括:

  1.  根据 DAPI 细胞核形态识别肿瘤上皮,并计算上皮面积占整个组织面积百分比;
  2.  对 ROI 内所有细胞核进行识别,筛选出细胞碎片以及异型性细胞,统计其百分比;
  3.  对细胞质 Cy5 染色,进行细胞质位置特异性识别,统计阳性率;
  4.  对细胞核 FITC 染色,进行细胞核位置识别,统计阳性率;
  5.  统计 Cy5 染色与 FITC 染色中共表达细胞的阳性率分别统计距离肿瘤上皮区域 1-25 μm、25-50 μm、50-100 μm、150-200 μm 范围内,3/4/5 项的定量分析内容;

结合 TissueGnostics 公司定量分析软件 StrataQuest 的多种结构识别功能,可以在此解决方案中,根据实验需要,对不同来源肿瘤组织,进行肿瘤微环境内的免疫细胞、信号分子进行定量分析。由于目标细胞数量可以达到几百万甚至几千万,使在大数据水平探索细胞分子表达分布的模式,以及深度挖掘整理实验室样本库中已有样本的信息成为可能。

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奥地利 TissueGnostics(TG)公司作为产学研相结合型公司,致力于开发组织自动化显微成像和图像定量分析的整体解决方案,研发能够真正服务于科研人员的工具。TG 公司始终贴合实际需求,自成立之初就和欧洲各大科研院所、企业建立广泛且深入的合作,不断解决一线科研人员的问题,在组织图像量化技术上积累了丰富的经验。独有的 TissueFAXS Cytometry 技术在业界首次为用户提供了从影像到分析的全方位解决方案,解决了图像数据,特别组织图像难以准确定量和可信度低的痛点。2016 年,TG 公司获得国际扫描成像大赛影像分析单元第一名,充分证明了 TG 公司在该领域的领先优势。智能化的工作流程使科学研究更加高效准确。
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