细菌内毒素与抗内毒素治疗研究进展
摘要：综述了有关细菌内毒素的分子结构及其特征、识别机制、生物学效应及抗内毒素治疗的研究进展。
内毒素（Endotoxin）是一种革兰阴性细菌细胞壁的组成成分，其化学本质为脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）。LPS是诱发炎症反应过程中主要的致病成分，它通过诱导体内单核- 巨噬细胞合成并释放多种炎症介质，参与机体的免疫炎症反应，严重时可导致脓毒症或休克。另外，由于LPS对机体免疫系统的影响具有双重性，因而研究和探讨LPS的作用机理及特点，有利于临床上对革兰阴性细菌感染的防治。
LPS的分子结构及其特征
LPS存在于革兰阴性细菌的外膜，由脂类和多糖组成。多糖又分为O多糖和核心（中心）多糖（Core polysaccharide）。 O多糖位于脂多糖最外层与环境相接触，是革兰阴性细菌的菌体抗原（O抗原），典型的O多糖由20～40个重复单位组成，每个重复单位由3～7个糖分子构成，因为各菌种的O多糖种类和排列顺序均不相同，因此，O多糖又称为特异性多糖，是革兰阴性细菌分类的重要依据。0多糖的结构是LPS 中最易发生变化的部分，并可引起特异性的免疫反应。核心多糖位于O多糖与脂类之间，可分为连接O多糖的外核部分和连接脂类的内核部分。核心多糖相对稳定，当LPS缺乏O 多糖时，它也能诱导抗体产生，但抗体的影响作用较小。内核部分含庚糖和2-酮基-3-脱氧辛酸（KDO）两种特殊的糖类分子，它们在LPS结构中起连接多糖与脂类的作用。脂类主要指类脂A，位于LPS内层由2个葡萄糖胺、磷酸盐和一定量的脂肪酸组成，为LPS中最稳定的部分。目前认为在LPS结构中只有类脂A及KDO部分具有毒性，此结构部分具有激活机体免疫系统的作用。
LPS的识别机制
单核-巨噬细胞、中性粒细胞是参与LPS应答的主要靶细胞，宿主细胞对LPS的应答曾被认为是细胞病理、生理和药理学活性的一个从启动到终止的过程。现已认识到LPS 能"识别"靶细胞并诱导其产生和释放具有免疫活性的细胞因子和其它宿主炎症反应介质。
LPS诱导的细胞活化主要由LPS受体系统包括吞噬细胞表面上多种LPS受体。mCD14作为GPI锚蛋白存在于单核- 巨噬细胞及中性粒细胞膜表面，与LPS有较高的亲和力，是 LPS关键的膜结合位点，在LPS结合蛋白（LPS-Binding Pro tein，LBP）存在时，可介导低剂量LPS诱导细胞活化，释放炎症因子如肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素1（IL-1）等，被认为是LPS信号传导中最重要的LPS受体。但近年来的研究越来越清楚地认识到：CD14缺少跨膜区，不能直接同细胞内信号分子进行交流，其功效可能是结合LPS，并使之局限于细胞膜的局部区域，传递并放大LPS的诱导作用。在介导的细胞活化中，必须借助于其它跨膜蛋白，但这种跨膜信号的传递机制目前尚未确知。
果蝇中有一种与抵抗真菌感染有关的受体蛋白，称为 toll蛋白。该蛋白能够活化信号传导过程，导致前炎性细胞因子的产生。1997年Janeway等发现人类也有toll蛋白受体的同源物，称为toll蛋白样受体（Toll like receptor，TLR）。最近研究表明TLR是LPS直接的信号传导器，在天然的免疫应答中起"哨兵"作用，是机体抗微生物病原菌的第一道防线。对TLR4基因缺失变异的C57Bl/10ScCr小鼠的研究进一步证实了TLR4可识别并结合LPS，并作为LPS的跨膜转导蛋白。从TLR4基因缺失小鼠中分离出的巨噬细胞和B细胞对LPS低敏，说明LPS信号传导中需要TLR4的参与。转染了人类TLR4基因的293细胞，可以被LPS-CD14呈剂量及时间依赖性活化，引起NF-κB及其控制的相关基因的激活与表达。提示它与LPS发生作用是具有LBP依赖性的，CD14的协同存在可增强它对细胞的活化能力，表明CD14可通过 TLR来转导LPS诱导的细胞活化。
由此可见，LPS的识别机制很可能为：LPS通过类脂A与 LBP结合，形成LPS-LBP复合物后进一步与CD14结合才能刺激细胞，使信号向胞内传递而表现出生物学活性。
LPS的生物学效应
LPS诱导产生的细胞团子及其作用
LPS所引起的多种生物学效应并非是由于直接作用于靶细胞的结果，而是LPS首先直接作用于机体内单核-巨噬细胞，诱导其分泌多种介质分子，并借助这些介质分子在局部或随血液循环至全身各部分而发挥其生理作用。
在LPS诱导产生的多种介质分子中，细胞因子最为明显。其中TNF及IL-1是由LPS诱导产生并在免疫炎症及感染性休克病理反应过程中起关键作用。许多研究结果表明，高浓度的TNF单独作用便可引起某些类似于LPS介导的病理变化，如发热、出血、不可逆性休克乃至死亡。并且发现临床上感染性休克及败血症病人血中的TNF含量明显升高，且其含量与病人病情紧密相关。同样发现IL-1可诱导免发生败血症及休克。在引起细胞损害方面，发现LPS、TNF、IL-1之间存在协同作用，IL-1与TNF可协同介导内毒素休克的发生。IL-1和TNF协同作用以诱发血管扩张和白细胞介导的组织坏死，形成器官衰竭，乃至死亡。另外，由LPS刺激巨噬细胞产生的IL-6和IL-8具有类似于TNF及IL-1的作用。在败血症、休克病人中IL-1β、TNF及IL-6水平的增高与病人的死亡率相关，这些病人中IL-6是最易于持续增高的一种细胞因子，且与死亡率紧密相关。提示IL-6的异常表达和失调很可能是某些疾病的典型特征，从而使IL-6成为可能与发病机理直接相关的第一个细胞因子。动物模型和临床研究也表明宿主体内TNF-α和IL-6水平的高低直接与细菌感染疾病的严重性及预后相关。近年来研究发现TNF－α、IL－6与感染性休克关系密切。可见，在炎症及感染性休克发生过程中尽快检测细胞因子水平是很有意义的。
关于TNF或IL-1在革兰阴性细菌感染中的作用，一般认为TNF或IL-1产生的量及其所在部位对感染病人的病情发展有较大的影响，如果在肝和脾中产生适量的TNF或IL-1则有利于病人的预后；但若在血液中形成大量的TNF或IL-1，则只会加重病情。
因此，LPS诱导单核-巨噬细胞产生的细胞因子，一方面可激活机体局部或整体免疫系统参与抵制细菌感染；另一方面若感染严重，机体内大量LPS与单核-巨噬细胞接触，产生大量炎性细胞因子而导致失控性炎症反应，导致感染性休克甚至器官衰竭。
总之，以TNF和IL-1为代表的细胞因子可发挥免疫调节作用以增强机体的抵抗力，细胞因子对内毒素休克病人的防御功能具有重要的调控作用。
LPS的病理生理作用
LPS可引起心血管系统通透性的改变。人们很早就发现细菌内毒素对血管内皮细胞具有激活损伤作用。血管内皮细胞被激活损伤后，易于黏附各种白细胞并分泌IL-1β、IL-6、 IL-8和VCAM－1、ICAM-1等细胞因子；内皮细胞通透性的增加，以及细胞连接的破坏，导致微血管通透性增加，单核细胞、中性粒细胞等易于穿过血管壁进入局部组织，引起局部炎症反应，严重时可导致休克，乃至死亡。至于LPS是直接作用还是通过释放细胞因子如TNF等间接作用于心血管系统，目前尚不清楚。
LPS还可通过损伤枯否细胞（Kupffer cell，KC）和肝细胞从而对肝脏产生影响。生理条件下，门静脉血中有约1ng/ml 的LPS存在。严重创伤及感染后，LPS大量进入血液，其浓度显著升高。在内毒素所致肝脏损害的研究中，以Ⅲ型蛙病毒特异性破坏KC后，导致肝细胞的广泛坏死。另外，Scotte 等在研究中发现，大鼠门静脉注射LPS能诱导KC中IL-1、 IL-6、TNF-α炎性细胞因子mRNA表达的增加。这些炎性细胞因子尤其是TNF－α被认为是介导损伤的主要介质，在大鼠门静脉给予TNF-α可导致类似LPS所致的肝损伤。
LPS还可引起肺的病理改变。陈永华等的研究表明，注射LPS后3h，低剂量组（1mg/kg）可观察到肺表面有针尖样出血点，至8h出血加重，呈斑片状出血，但不超过一侧肺叶的1/4。光镜下观察到炎性细胞浸润及肺间质增厚的程度呈时间依赖性增加。高剂量组（10mg/kg）解剖观察，1～3h 即可出现接近肺叶1/4～1/3面积的斑片状出血点，到8h出现极重度出血，出血面积超过一侧肺叶的50%。光镜下见大量炎性细胞及肺泡水肿。
至于LPS对胃、肠道、脾脏及皮肤的病理生理作用，则研究甚少。
LPS引起的耐受和超敏
研究发现，当用内毒素刺激单核-巨噬细胞时，这些细胞便会产生大量的细胞因子如TNF等，当第二次刺激时，该反应却很微弱，这种现象即为LPS耐受（Tolerance）。而超敏反应（Hypersensitivity），又称为变态反应（Allergy），是机体再次受相同抗原或半抗原刺激后，产生体液性或细胞性的异常免疫反应，从而引起组织损伤或生理机能障碍。个体差异决定了宿主细胞和组织对LPS的耐受和敏感。在研究LPS耐受性和超敏反应中，已建立了两个较好的模型。
其一为C3H/HeJ纯系小鼠，该种小鼠对极高浓度的LPS 亦有抵抗其病理效应的能力，但却对革兰阴性细菌的感染高度敏感，表明C3H/HeJ小鼠的巨噬细胞不对肠道来源的LPS 刺激发生反应，从而降低了对LPS的外源性抵抗力。
另一LPS低反应性模型为"获得性无反应型"。有两种诱导性内毒素耐受性。"早期"内毒素耐受性是暂时的，并由亚致死量LPS诱发而成。在"致耐"注射后，对LPS的反应在 3～6天内消失，然后恢复正常。耐受性的发生常伴有明显的特异性生成改变及LPS刺激后产生的细胞因子能力下降。研究发现，如在"致耐"注射时使用抗TNF抗体或重组IL-1Ra，耐受性可被阻断。说明，对LPS耐受性的诱发原因可能部分是由细胞因子所致。"晚期"LPS耐受性为长期持续性的O- 抗原特异性，且是抗LPS抗体产生后的结果。与早期耐受性不同，晚期耐受性仅对诱发耐受状态的LPS表现特异性。
由此可见，研制相应药物用于临床来干预诱导机体产生 LPS耐受，对于控制免疫炎症及由此引起的败血症或休克具有重要意义。
抗内毒素治疗
LPS抗体及其在克疫治疗中的应用
虽然多种抗生素能够有效地杀死入侵的病原菌，但由于内毒素是革兰阴性细菌细胞壁的组分之一，因此只有早期使用抗生素，抑制细菌的繁殖，才可防止内毒素血症的发生；若细菌大量繁殖后才使用抗生素则会加重病情。因此，到目前为止尚未制成能够降解内毒素并适于病人使用的安全、有效的抗生素。抗内毒素的研究集中在发展内毒素抗体的免疫治疗上。大多数哺乳动物包括人类在LPS刺激体液免疫后均可产生LPS抗体。这是LPS抗体用于免疫治疗的基础，也使用LPS抗体治疗内毒素休克成为可能，Field等利用抗独特型抗体（MAb4G2）作为LPS上保守抗原决定簇的内在替代影像以刺激机体的免疫系统，观察其对小鼠内毒素致死性攻击的保护作用。结果发现，MAb4G2可以作为内毒素血症的有效预防疫苗，它不同于LPS，本身是蛋白质抗原，激活T 细胞依赖的免疫应答，具有记忆反应和亲和力成熟的特点。
LPS抗体一般是与细菌表面暴露的LPS反应，抗体的抗菌活性与它们对补体的激活能力密切相关。但机体清除LPS 的确切作用机制，目前尚不清楚。根据LPS化学结构各部分的免疫化学性质，人们在研究中发现，抗核心多糖抗体和抗类脂A抗体可能对不同的革兰阴性细菌感染具有交叉保护作用。
在抗核心多糖和类脂A的多克隆抗体方面，人们用杀死的粗糙型（缺乏O特异多糖侧链）大肠杆菌或其LPS或类脂 A作疫苗免疫动物所获得的抗血清，能够减轻LPS介导的毒性，表现在降低受LPS攻击的实验动物死亡率，也能对其它种属的革兰阴性细菌所致的动物败血症起保护作用。其中 Rc型大肠杆菌J5抗血清已被试用于临床，但令人遗憾的是 J5抗血清对革兰阴性细菌脓毒症的治疗效果并不理想。
在抗核心多糖和类脂A的单克隆抗体方面，有许多文献报道了多株针对核心多糖或类脂A单克隆抗体的特性及其保护作用，但目前仅有2株单克隆抗体，即E5（Xoma Berkeler，美国）与HA-1A（Centocor，美国）已完成败血症治疗的临床应用研究，但效果不佳。
LPS抗体临床治疗效果不理想的可能原因，一方面是由于LPS抗体仅特异地和一种细菌内毒素结合，而临床上很难及时鉴定患者的致病菌种，因此限制了LPS抗体的使用；另一方面，内毒素入血后可能与血中的脂蛋白或其它急性期反应蛋白结合，使内毒素的核心多糖和脂质A被掩盖，而不被抗体识别。因此，LPS抗体的远期有效性和安全性还有待于进一步观察和评价。
细菌通造性增加蛋白（Bactericidal permeability-increasing protein，BPI）
由于临床试验使用的抗体与内毒素亲和力低，不能中和内毒素。目前正在研制高亲和力、能中和内毒素的制剂，包括肽类和脂蛋白。中和内毒素，防止其与效应细胞的结合，不仅是内毒素血症早期治疗的主要目标，也是防治内毒素休克最关键的环节。到目前为止，已报道的能结合并中和LPS 的蛋白质只有少数几种，包括多动菌素B和BPI。
虽然多黏菌素B具有中和LPS和降低LPS攻击动物死亡率的作用，但由于其具有神经毒性和肾毒性，在临床上的应用受到一定限制。。
BPI是从多形核粒细胞（PMNs）的嗜天青颗粒中分离出的一种阳离子蛋白质，分子量为55kD，具有特异性杀伤革兰阴性细菌的作用。BPI与LPS的类脂A具有高度亲和性，能识别结合并中和光滑型和粗糙型LPS以及类脂A，使LPS分子聚集，不仅抑制LPS活性，而且也阻止了LPS与LBP及CD14 的结合，是最具应用前景的一种蛋白质。近年来将21kD部分重组的BPI应用于儿童脑膜炎球菌感染，取得良好疗效，该药已进入三期临床试验。BPI作为一种"超级抗生素" 被认为是一种存在巨大潜力的抗内毒素和革兰阴性细菌感染的药物，已成为研究的热点。
细胞因子拮抗剂
对内毒素致病机制的研究表明，内毒素诱发的炎性细胞因子对组织细胞的损害远远超过内毒素本身对机体的直接影响，因而研制抗炎性细胞因子的生物制剂并探讨其临床疗效又成为人们关注的焦点。然而，不容乐观的事实是，尽管抗炎性细胞因子的生物制剂如抗TNF-α、IL-1抗体及其受体拮抗剂在动物实验的疗效显著，但临床试用疗效却不理想。另外，细胞因子在机体的炎症防御反应中起着一定的保护作用，抑制细胞因于可能对某些病人不利。因而细胞因子疗法目前还存在一定的难度，如给药的剂量、时间的选择、治疗持续时间以及给药途径等问题都有待于解决。
（王永堂 伍亚民 第三军医大学大坪医院野战外科研究所
鲁秀敏 西南农业大学生物技术中心）
（中国生化药物杂志） }