优化 ALDEFLUOR™ 检测以测定目的细胞的 ALDH 活性

ALDEFLUOR™ 检测是一种基于乙醛脱氢酶（ALDH）活性来鉴定人干/祖细胞的非免疫学方法。最初用于检测人脐带血、骨髓和外周血中的造血干/祖细胞。如要检测其他细胞类型中的 ALDH 活性，可能需要调整不同的测定条件以获得最佳的结果。 

对于非造血细胞，我们提供不同的优化方法。以下建议可能有助于提高 ALDHbr 细胞的荧光强度以更好地区别于阴性对照：

• 增加 DEAB 抑制剂浓度 - DEAB 的抑制效果在不同来源和物种的细胞中会有所不同。首先将加入每次反应的抑制剂量加倍。视情况而定，后续可能需要显著增加剂量（可高达 10 倍）。

• 优化 ALDEFLUOR™ 试剂浓度 - 浓度测试范围可从降低 5 倍到提高 10 倍以上。

• 在添加 ALDEFLUOR™ 试剂前加入 DEAB 抑制剂 - 准备 2 个试管（对照组和试验组），每个试管含有 0.5 mL 推荐浓度的细胞。向对照管中加入 5μLDEAB 并混匀。然后向每个试管中加入 2.5μL 活化的 ALDEFLUOR™ 试剂并立即混匀。某些细胞系具有非常高的 ALDH 活性，并且很难抑制，即使在向 ALDEFLUOR™ 试剂起反应的细胞中添加抑制剂这样短的时间内，也是如此。在反应前添加抑制剂可以帮助识别高表达细胞中的 ALDHbr 群体。

• 优化孵育时间 - 使酶反应时间更短。我们建议尝试 15、30、45 和 60 分钟的孵育时间。例如，SKRB3 乳腺细胞系的最佳孵育时间为 30～45 分钟，如孵育整整一个小时会导致较低的荧光强度。

• 优化细胞浓度 - 反应基于试剂的摩尔浓度，因此造血细胞的浓度应保持在每毫升 1×10⁶ 个细胞。但是，不同类型的样本可能产生不同的结果。降低细胞浓度可以增强信号以更好的区分 ALDHbr 细胞群体。例如，SKRB3 细胞的浓度为每毫升 1～2×10⁵ 个细胞时，ALDEFLUOR™ 信号更强。由于不同物种的 ALDH 活性不同，我们建议测试一定范围内的细胞浓度，即测试高于和低于造血细胞的推荐浓度。

• 补充其他的 ABC 转运蛋白阻滞剂以抑制蛋白质的外排 - ALDEFLUOR™ 缓冲液中已有的 ABC 转运蛋白阻滞剂可能不适用于非人类的物种。其他的 ABC 转运蛋白阻滞剂，包括在灵长类物种中可能会效果更好的维拉帕米（50～100 μM），对鼠类样本可能会更有用的丙戊酸（2.5 mM）和/或 2-脱氧-D-葡萄糖（10～100 mM）。

• 通过谱系去除方法对祖细胞群进行富集 - 在一些物种和组织中，非祖细胞可能表达出较高的 ALDH 活性，从而掩盖祖细胞群的 ALDH 活性。在使用 ALDEFLUOR™ 进行测定前去除谱系细胞来对祖细胞群进行富集并提高测定读数的准确性。

所需的优化会因细胞类型的不同而有所差异。有时只需调整单个参数（例如细胞浓度），而有时则需要更改一个以上的参数（例如，降低 ALDEFLUOR™ 的试剂浓度并且先加入 DEAB 抑制剂）。

请观看我们的网络研讨会，优化 ALDEFLUOR™ 检测，了解专为您感兴趣的细胞类型定制的 ALDEFLUOR™ 的染色技巧。如想了解更多信息，请联系技术支持部门（info.cn@stemcell.com）。 

编辑： z翟某某    来源：丁香园