为 ALDHbr 检测分析设置对照和设门

ALDH^br 检测是一种基于流式细胞术的检测方法，用于检测活的、表达高水平乙醛脱氢酶（ALDH）活性（称为 ALDH「明亮」或 ALDH^br）的人脐带血细胞，且细胞表面表达 CD45 和 CD34 标志物。ALDH^br 检测的有效性取决于其染色结果、数据采集和分析方法的可重复性。

为准确补偿荧光信号并设置合适设门来计算 CD45+活细胞群中的 ALDH^brCD34+细胞的百分比，需要制备合适的阴性、单色和荧光扣除对照（FMO）。

样品及其对照的制备

制备用于 ALDH^br 检测分析的细胞包括 2 个阶段。第一阶段是测量每个细胞中 ALDH 活性的酶促反应。被检测的细胞与经活化的 ALDEFLUOR™试剂一并孵育、其中，BODIPY™氨基乙醛（BAAA）被 ALDH 的酶活性转化为带负电荷 BODIPY™氨基乙酸酯（BAA），滞留在细胞内。至于阴性对照，另一个细胞样品与 BAAA 一起被孵育在含有 ALDH 抑制剂二乙氨基苯甲醛（DEAB）的试剂中。

在第二阶段，用抗 CD45、CD34 和血型糖蛋白 A/B（GlyAB）的抗体对测试和对照细胞样品进行染色。同时，也要准备好补偿和 FMO 对照管。表 1 展示了测试和阴性对照样品（含有 DEAB）的染色方案。每个测试样品需要重复该染色步骤（包括阴性对照的制备）。表 2 显示了补偿和 FMO 对照样品的染色方案。每次实验应至少对一个样品进行补偿和 FMO 对照染色和分析。有关样品制备和试剂的更多详细信息，请参见 ALDH^br Assay Kit 产品页面。

设门和数据分析

绘制一个侧向角散射（SSC）和前向角散射（FSC）的密度点图。使用 DEAB 对照；调整 FSC 和 SSC 电压和增益，使有核细胞群置于 SSC 与 FSC 密度图的中间位置。

注意事项：由于目标细胞群是 SSClo，避免使用 SSC 阈值。在密度点图上绘制一个大区域，包含有核细胞群。

1. 绘制以下补偿对照样品的二维密度点图：
    a. SSC 与 7-AAD/PE-Cyanine5 GlyAB
    b. SSC 与 PE CD45
    c. SSC 与 BAA
    d. SSC 与 APC CD34

2. 使用单色对照样品设置不同荧光通道之间的溢出补偿。根据流式细胞仪的类型和使用的软件，可以在数据采集之前或之后设置补偿。

3. 补偿调整后，为每个测试样品绘制以下二维密度点图：
    a. SSC 与 FSC
    b. SSC 与 7-AAD/PE-Cyanine5 GlyAB
    c. SSC 与 PE CD45
    d. SSC 与 BAA
    e. APC CD34 与 PE CD45

4. 然后依次绘制五个设门，来鉴别 7-AAD-GlyAB-CD34+CD45+ALDH^br 细胞亚群中活的、有核（7-AAD-GlyAB-）细胞、CD45+细胞、低 SSC 的 ALDH^br 细胞和 CD34+细胞。设门边界取决于 FMO 设门对照。图 1 显示的是确定此细胞亚群百分比的经典的设门策略。

图 1. 鉴别 7-AAD-GlyAB-CD34+CD45+ALDH^br 细胞的设门策略
图示为定量脐带血样品中 7-AAD-GlyAB-CD34+CD45+ALDH^br 细胞百分比的设门策略。（A）完全染色样品分析的点状图，（B）BAA FMO 管的对照图。在本示例中，（A）测试和（B）对照样品的数据首先对 7-AAD-GlyAB-（在相同荧光通道中测量）和 CD45+细胞进行设门，以便分别排除死细胞、GlyAB+红细胞（RBC）和 CD45-非造血细胞。DEAB 对照样品也可用作阴性对照，但由于它没有用抗 GlyAB 或 CD45 的抗体或 7-AAD 进行染色，所以 DEAB 对照样品的 SSC 与 ALDEFLUOR™（BAA）点状图（如 B 所示）仅使用在 SSC 和 FSC 上进行设门的数据绘制。

注意事项：强烈建议在染色前从脐带血样品中去除红细胞，因为这样可以在设门时提高分析的准确性，从而实现更快速的数据收集并生成较小的文件。

有关我们 ALDH^br Assay Kit 或使用和分析此检测方法的更多信息，可联系 info.cn@stemcell.com。