ReproRNA™-OKSGM 实验流程中如何优化嘌呤霉素筛选步骤？

ReproRNA™-OKSGM 为单链 RNA 复制子、非整合型的重编程载体。该载体包含一个嘌呤霉素抗性基因片段，用于筛选出含此载体的细胞。因此，没有含此载体的细胞会被嘌呤霉素去除。在转染后的第 1 到 6 天进行筛选，可去除培养中未被转染的成纤维细胞。STEMCELL Technologies 推荐的筛选过程中嘌呤霉素的使用浓度为 0.8 μg/mL。该浓度既保证嘌呤霉素的毒性足够去除未被转染的成纤维细胞以降低背景，又不会过量而对转染过的细胞具有毒性，导致重编程效率降低。对于一些特定的细胞系，如果在筛选步骤后发现剩余细胞或者被去除的细胞过少，说明 0.8 μg/mL 嘌呤霉素并不是一个合适的浓度。在此情况下，可按照以下步骤做一个细胞毒性检测来决定适当的浓度。

1. 成纤维细胞以 5 x 10⁴ cells/mL 的浓度接种于 96 孔板，并使用成纤维细胞培养基在 37 °C，5% CO₂ 条件下孵育过夜，使细胞贴壁。 
成纤维细胞培养基：
高糖 DMEM； 
10% (v/v) FBS（胎牛血清）； 
1% (v/v) 非必需氨基酸； 
2 mM L-谷氨酰胺。

2. 第二天，制备含不同浓度嘌呤霉素的成纤维细胞培养基。请参见下面表格中的示例，您可根据需要来选取不同嘌呤霉素浓度或样本重复数。例如，选取嘌呤霉素浓度为 1.2，1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0.1 和 0 μg/mL。

3. 在显微镜下观察 96 孔板，确认成纤维细胞已贴壁。通常情况下，细胞密度大约为 80%。

4. 将原培养基换成含不同浓度嘌呤霉素的培养基，在 37 °C，5% CO₂ 下培养过夜。

5. 在之后的 5 天内每天重复步骤 2-4。请注意：需当天制备新鲜的含嘌呤霉素的培养基，我们不建议一次制备所需的全部培养基。

6. 在第 5 天，使用细胞活性检测（如 MTT 或 LDH）得到能够去除 80～100% 的细胞的最小嘌呤霉素浓度。使用此浓度进行后续的 ReproRNA™-OKSGM 实验的筛选步骤。

示例：在 96 孔板中每个样本进行三次重复实验

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