CAR-T 细胞基因转导
CAR-T 细胞基因转导概述
CAR-T 细胞基因转导具有一定的挑战性，慢病毒载体、逆转录病毒载体、转座子和 mRNA 电穿孔技术是较为常见转导方法，这些技术的进步赋予 T 细胞新的生命力，实现了对靶细胞高、精、准的持久杀伤，极大地提高了肿瘤特异性 T 细胞的临床治疗效果；但仍存在一些问题，如插入突变、转导效率和成本收益等，因此，在基因转导方法的研发过程中，在重视转导效率和安全性的同时要兼顾产品特性和成本。在科学技术飞速发展的今天，T 细胞基因转导方法将会得到进一步发展和完善。下面简单介绍以 γ-逆转录病毒载体介导的 CAR-T 细胞基因转导。
为了产生携带目的基因的载体，需将 γ-逆转录病毒的编码序列替换为 CAR 基因。重组病毒基因组成功包装成病毒颗粒需要伴随 gag，pol 和 env 基因的表达，它们分别编码衣壳蛋白，复制酶和包膜糖蛋白，且以不含任何包装信号的异源亚基因组辅助质粒的反式方式存在。将编码序列和调控序列分离成不同的核酸分子限制了它们转移到有复制能力的逆转录病毒（replication competent retroviruses, RCRs）中，从而增加了安全性。当转染到包装细胞系中时，载体质粒允许合成许多病毒基因组拷贝，随后通过结构蛋白将其包装成病毒颗粒。转导后的事件与真正感染的事件非常相似，在 γ-逆转录病毒和活化的 T 细胞膜融合后，病毒粒子核心被释放到胞质溶胶中并沿着微管运输到达细胞核。破坏的核膜对其进入细胞核至关重要，因此 γ-逆转录病毒载体的生产性转导严格依赖于靶细胞有丝分裂。
图 1. γ-逆转录病毒载体构建示意图
CAR-T 细胞基因转导方法
随着高效的病毒载体和理化基因转导技术不断发展，在临床试验中表现出各具特色的应用潜力，勾勒出肿瘤免疫治疗的美好前景，下面就几种常用的 T 细胞基因转导方法做简单介绍。
γ逆转录病毒载体：逆转录病毒载体（retroviral vector, RV）是第一个也是广泛应用于临床的病毒载体。γRV 转染范围广，能转导多种类型的细胞，但由于外周血淋巴细胞没有进行有效的循环，所以它们在被 γRV 成功转导之前需要被体外激活；病毒基因组能整合到宿主基因组，保证目的基因长期、稳定地表达；转基因负荷量大；生产技术成熟，可批量生产。
慢病毒载体：由于慢病毒载体（lentiviral vector）含有顺式作用元件中央多聚嘌呤区（central polypurine tract，cPPT）使其能有效感染静止 T 细胞。慢病毒载体转导效率接近 100%，高于 γRV；转基因负荷量更大，可容纳 6.5 kb 的外源基因且基因毒性更小。这些优势让科研人员以极大的热情投入到慢病毒载体的研究中，临床试验也日益增多。
转座子：病毒载体的致病性和潜在的插入诱变可能性在人类临床试验中存在显著的监管障碍，非病毒载体的开发显得十分重要。转座子和 mRNA 电穿孔技术是目前研究比较多的两类非病毒载体系统，转座子最终可能发展成多功能 T 细胞基因转移系统，但目前的 DNA 电穿孔方法通常产生较差的细胞活力，临床应用中需要扩大 T 细胞培养以产生大量 T 细胞。
mRNA 电穿孔技术：目前，mRNA 电穿孔被认为是最安全的 T 细胞基因转导方法。将编码目的基因的 mRNA 与增加稳定性和长期表达的修饰物，通过电穿孔技术导入细胞质中，mRNA 不需要进入细胞核就能表达，发生插入突变的几率极低。mRNA 电穿孔技术能转导静止或增殖缓慢的 T 细胞；转导效率高，多在 90% 以上；设计相对容易，性价比高。
CAR-T 细胞基因转导相关产品
• 细胞转染试剂产品列表：
| 产品名称 | 产品描述 | 货号 |
| Sinofection® Transfection Reagent | 获取的重组慢病毒 TCID50 可以达到 107 以上 | STF02 |
• 细胞培养基产品列表：
| 产品名称 | 产品描述 | 内毒素含量（EU / mL） | 货号 |
| SMM 293-TI 无血清培养基 | 无动物源组分、无血清、无抗生素 | < 10 | M293TI |
• 核酸酶-Supernuclease (Benzonase® 同类核酸酶 )：
| 产品名称 | 纯度（by HPLC） | 内毒素含量（EU/mg） | 货号 |
| SuperNuclease | >99% | <0.22 | SSNP01 |
CAR-T 细胞基因转导相关资讯
慢病毒载体用于 CAR-T 细胞基因转导
γ-逆转录病毒载体用于 CAR-T 细胞基因转导
转座子用于 CAR-T 细胞基因转导
mRNA 电穿孔用于 CAR-T 细胞基因转导
参考文献
1. 牟艳芳，张文峰，邵红伟，黄树林. T 细胞受体基因转导及应用的研究进展. 广东药学院学报. 2009;25(1):101-104
2. 查显丰，李杨秋. 抗原特异性 T 细胞受体基因转导技术优化策略的研究进展. 国际免疫学杂志. 2010;33(3):173-177
3. 潘鹏宇, 韩双印等.T 细胞基因转导方法及其在肿瘤临床研究中应用的进展. 中国肿瘤生物治疗杂志.2016;23(2):287-290
4. Richard A. Morgan and Benjamin Boyerinas. Genetic Modification of T Cells. biomedicines. 2016, 4, 9