Real Time qPCR 您身边的基因转录实时监控专家

基因作为生物体最为重要的信息载体，储存着生物体全部的遗传信息，决定着生物的性状、分类、生命周期等各种特征，然而基因往往不直接参与生命活动的调控。对于高等生物，在满足「中心法则」原则的情况下，基因（DNA）通过转录形成 RNA，一些 RNA 通过特定的方式翻译形成蛋白质，而蛋白质才是直接参与生物性状决定的最主要物质。RNA 作为联系基因和蛋白的重要桥梁，在基因信息的翻译以及调控基因转录、核酸剪切等多方面的具有重要作用，这也使得对于 RNA 的研究和检测显得尤为重要。

RNA 检测其实对于我们每个人都不陌生，前段时间令人闻风丧胆的禽流感病毒和乙型肝炎病毒复制度的检测。天然状态的 RNA 常为单链，结构不稳定，容易被 RNA 酶降解，需要在逆转录酶的作用下转化形成更为稳定的 cDNA，以方便检测。目前 cDNA 定量检测方式主要以 Real Time qPCR 染料法和 Real Time qPCR 探针法为主。

Real Time qPCR 染料法 (如图 1 所示) 采用一种能与 DNA 特殊结合的荧光染料 SYBR Green。SYBR Green 属于一种结构扁平的化学小分子，具有微弱的荧光，能够特异性与 DNA 的小沟结合并发出强烈荧光，荧光的强度与体系中 DNA 的含量成正比。染料法具有操作简单、价格便宜等诸多优点，但是也存在由于荧光染料能与所有的 DNA 结合而引起的特异性不强、只能相对于内参进行相对定量等缺点，这也决定了染料法通常仅限于实验室使用，而在医学诊断中使用有限。

Real Time qPCR 探针法（如图 2 所示）需要人工合成带有发光基团 R 和淬灭基团 P（常采用 MGB 修饰）的单链 DNA 探针以及一对特异性的 PCR 引物。单链 DNA 探针需特异性的识别和结合 cDNA 预扩增区域。当发光基团和淬灭基团与 DNA 探针结合完好时，反应体系将不具有荧光，而在 PCR 的过程中，由于 Taq 酶具有 5′-3′外切酶活性 (此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)，将会使与 cDNA 结合的探针 5′端的发光基团游离出来而发出荧光，荧光的强度与复制的次数成正比。探针法虽然存在操作较复杂、价格偏高、探针设计和标记复杂等方面的不足之处，但是具有特异性强，测值稳定，能够完全定量等一系列的特点，使得探针法能在医学诊断中被广泛使用。

Cloud-Clone Corp. 长期为客户提供 Real Time qPCR 检测服务，在引物和探针设计、合成方面积累了大量的经验。同时配套有动物模型和细胞实验服务，为客户提供更为全面的一站式服务体验。

编辑： dxy_8hxjask7    来源：丁香园