应用分享 10—含毒单细胞测序助力重型登革热的发病机制研究

导读

登革病毒（DENV）是全球健康的主要威胁之一，据统计，每年有 4 亿人感染登革热，其中有 5% 至 20% 在 4 到 7 天内发展成重型登革热（SD），临床表现为出血、休克、器官衰竭，甚至死亡。早期支持性治疗可降低患者死亡率，但是目前还没有方法可以预测哪些患者会发展为 SD。近些年科学家开始研究 SD 病人早期血液中的生物标志物，他们重点关注两种实验技术：（1）流式细胞术检测的固定血液群体；（2）从血液或 PBMCs 中提取大量 RNA 进行基因检测。这些研究大都确定了与 SD 相关的基因，但不在 SD 发病之前，因此不能作为后期病变的预测生物标志物。从技术角度看，流式细胞仪适合检测已知标志物、分群比较明显的细胞群，但不太适合筛选复合物，检测细胞类型、亚型和免疫反应的动态变化，难以确定含 DENV RNA 的 PBMC。大量细胞的转录组测定可以筛选数以千计的基因，但其分辨率有限，因为不能获取组织的异质性，不同细胞群的平均信号会因多种细胞类型和不同激活状态被混淆。

该文献中，研究者结合 FACS（荧光激活的细胞分选）与 viscRNA-Seq（含病毒的单细胞转录组测序）鉴定患者血液中含 DENV RNA 的免疫细胞，并在患者发展成 SD 前预测分子信号。

▊ FACS-assisted viscRNA-Seq workflow

液样本来自 4 名健康对照组和 6 名 DENV 感染患者，2 名患者病情较轻，4 名患者后面进展成 SD。患者的疾病严重程度根据 2009 年世界卫生组织标准进行了分类。获取 10 名受试者的外周血单个核细胞（PBMC）、全血和血清样品，并通过 qRT-PCR 和血清学方法确认是 DENV 感染而非其他虫媒感染。

用 PBS 将全血按照 1:1 稀释，加入含 15 ml Ficoll 的 SepMate 管中，1,200 g 离心 10 min，然后将 PBMC 层吸入新的管中并用 PBS 洗涤，250xg 离心 10 min 后，用冻存液重悬，进行冻存。

a. 将细胞在 37 ℃ 水浴中复苏，加入 9 ml 温热的培养基，300 g 离心 8 min，弃上清液加入 2 ml 培养基重悬。用同样的条件离心后弃上清液，将细胞重悬于含 1% BSA 100 μl  的 PBS。加入 5 μl Fc  受体封闭液，室温孵育 15 min。加入 300 μl PBS，补充总体积到 405 μl。将细胞悬浮液分成 3 或 4 个等份（100 μl/份），每份加入 10-30 μl 抗体混合物（3 μl/抗体），冰上孵育 45 min，然后加入 1 ml PBS。加入 1 μl SYTOX Blue 染死细胞，37 ℃ 室温孵育 5 min。用 35-40 μm 过滤器把细胞过滤到流式管中，再加入 1 ml PBS 补充总体积到 2 ml。

b. 准备一个带裂解液的 384 孔（裂解液体积 0.5 μl），裂解板含有多腺苷酸化 mRNA 的捕获序列和 DENV 特异性捕获序列，使用 Sony SH800 细胞分选仪把「a」中的细胞悬液分选到该 384 孔板中，分选时使用 100 μm 的芯片和「Targeted」模式校准，然后进行逆转录，产生和扩增 cDNA。

c. 部分板子通过 Quant-iT™ PicoGreen™dsDNA Assay Kit 进行 cDNA 定量，并通过液体处理器自动标准化至 0.4 ng/μl，使用 Nextera XT 试剂盒制备测序文库和 Ampure XP 磁珠纯化 DNA。

d. 进行测序，同时定量单细胞病毒丰度和宿主转录组的变化。

Sony SH800 配备专门独特优化的「Targeted」液流模式，能够进一步提升分选液滴偏转精度，使得利用 96 孔板和 384 孔板进行单细胞孔板分选变得轻而易举；同时 Targeted 模式也适合于对较大或较脆弱细胞进行分选，可以更好地保证分得细胞的活性。

每个单细胞提供的信息包括：细胞类型，免疫激活状态，感染状态和病毒群体基因组学

▊ Sorting

All Events：调整 FSC 和 SSC 电压，选择 PBMC 细胞群体
A：去黏连体
C：死活染色或非目的细胞阴选
G：目的细胞共表达 marker 阳选
K：进一步设门，分析 T、B、NK、NKT、DC 和单核细胞群体
设定分选条件、进行各种细胞群的高通量单细胞分选

▊ Results

1）多种 IFN 应答基因，特别是 NaiveB 细胞中的 MX2 和 CD14+CD16+单核细胞中的 CD163 在 SD 病人前期以细胞特异性方式上调。
2）两名 SD 患者中含 vRNA 的细胞绝大多数都是 Naive IgM B，这种细胞高表达 CD69 和 CXCR4 受体和各种抗病毒基因，其次是单核细胞。
3）不含 vRNA 的 B 细胞还表现出免疫激活，另外来自两名患者的 IgG1 浆母细胞表现出克隆性扩张。
4）最小等位基因频率 (MAF) 的解读揭示了病毒群体的基因多样性。

Fig.3. 

Fig.4.

▊ Significance

• 描述了病人发展成为 SD 之前的成千上万单个血细胞的病毒 RNA 情况和转录组的概况；
• 发现了细胞特异性免疫激活和可能具备预测性的生物标志物；
• 确定了和病毒相关的最新特定细胞群，特别是 Naive B 细胞和单核细胞；
• 探讨了不含 vRNA 免疫细胞的免疫激活、克隆性和适应性免疫调节的体内变化，以及病毒基因组学。

多种方法学的研究可以提前了解病毒感染的发病机制，绘制被感染细胞的基因图谱，促进预测发展。

▊ 亮点解读

该研究的技术难点是难以确定含 DENV RNA 的 PBMC 和精准测定含 DENV RNA 的 PBMC 分子信息，SH800 流式分选仪支持 PBMC 多色方案分析，可以进行 384 孔板的高通量单细胞分选，保证了细胞的纯度和活性，为 RNA 测序实验提供了宝贵的样本，最后结合测序结果确定了含 DENV RNA 的 PBMC 和预测患者发展成 SD 前的分子信号，流式分选是本次研究的最关键性技术，为后续实验提供了基础。

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1 分钟插拔式更换，可实现样本之间零交叉残留
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充分满足研究者对不同大小细胞的分选需求
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便于对目标单个细胞追踪溯源

▊ Reference

1.Virus-inclusive single-cell RNA sequencing reveals the molecular signature of progression to severe dengue[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2018, 115(52): E12363-E12369.

图片来源：索尼生物

编辑： z翟某某    来源：丁香园