单个神经元测序-样本制备攻略

A Guide to Single-Cell Transcriptomics

in AdultRodent Brain: The Medium Spiny Neuron Transcriptome Revisited

「你是什么垃圾」

这不是一个段子，是很多上海市民近段时间不得不面对的问题。自从上海实行垃圾分类后，上海市民茶余饭后都在仔细研读垃圾分类表，动不动就来一句「吾考考侬，侬晓得 xx 是干垃圾还是湿垃圾伐？」 

垃圾要科学分类，从复杂的脑组织结构中分选出某一类神经元单细胞也是件颇有难度的事情，本文以成年啮齿动物中型多棘神经元为例，讲述了如何简化大脑单细胞分离步骤，这些步骤包括酶消化、组织研磨等。

人类大脑结构的复杂性给脑细胞发育和功能的机制研究带来了挑战，单细胞转录组学技术提高了异质细胞的分辨率，从而使得健康和疾病状态下功能特异性的脑细胞群体能够被深入研究，中枢神经系统（CNS）的单细胞 RNA Seq 研究大部分集中在已知区域例如大脑皮层，大脑皮层以外的 CNS 区域中型多刺神经元（MSN）研究较少。MSN D1 或 D2 多巴胺受体形成两条基底神经节通路，最近基于 BacTRAP 技术的 D1 和 D2 MSN 基因研究结果与多位科学家先前的研究结果不一致，原因可能是 D1 和 D2 MSN 亚型之间的基因缺乏单细胞分辨技术。单细胞数据有限的主要原因是成人大脑单细胞分离技术水平不高，另一方面是零碎髓鞘和神经纤维产生大量的碎片，第三个方面是一些缺乏解剖标志的脑结构不易被识别。本文针对这些问题提出了对应的解决方案。

1. 动物实验

立体坐标定位与 FACS 相结合，使用的动物品系包括 C57B16/J 和 BAC-转基因小鼠系 Drd1a-TdTomato 和 Drd2-EGFP。

2. 样本制备

组织切片：用冰冷的人工脑脊液（ACSF）灌注 8-12 周龄的异氟烷麻醉的动物，大脑固定在振动切片机上立即切片，样本浸润在含 Hibernate A 、B27 生长因子和 0.5 mM Glutamax 的 HABG 培养基中，所有组织都是冠状切片。

酶消化：使用预热的木瓜蛋白酶溶液 30 ℃ 轻轻摇晃消化 30 min，木瓜蛋白酶由无钙 Hybernate A、0.125 × Glutamax 制备成浓度为 2 mg/ml 使用液。重点是木瓜蛋白酶溶液同时含有渗透性核染料，DRAQ5（5 mM 溶液，3000 × 稀释使用）或 Hoechst 33258（10 mg/ml 1000 × 稀释使用）。

机械研磨：组织块用不锈钢针机械研磨 10 次以减小体积，在研磨过程中，使剩余的组织块静置沉降 2 min，上层 1 ml 溶液通过 45 μm 过滤器过滤到新管并换上新鲜的 HABG 培养基，使用更小针头继续研磨。

细胞死活染色：将细胞重悬于 14 ml HABG 培养基，培养基含死活染料 PI（1000 × 稀释，如果核染料是 Hoechst 33258）或 DAPI（1000 × 稀释的 10 mg/ml 母液，如果核染料是 DRAQ5）。细胞在 4 ℃ 1100 rpm（264 g）离心，轻轻地重悬于 HABG 中，在 FACS 之前使用 45 μm 细胞过滤器过滤。

3. 细胞分选 

部分分选实验在 Sony SH800 仪器上进行。细胞渗透性染料（标记细胞）和细胞不透性染料（标记死细胞）的组合根据仪器配置确定。将细胞收集到冷却的 96 孔 PCR 板，每孔含 2 μl 无核酸水，2%Triton-X100 和 RNA 酶抑制剂。

血液或细胞悬浮液通过流式细胞术检测的颗粒大部分是细胞，因此直接通过流式检测 PI 阳性（死）颗粒与所有颗粒的比率来评估单细胞分离各个步骤的活/死细胞比率。

流式细胞术分析成年小鼠脑的样本中发现：
（1）大部分颗粒尺寸比平时检测的细胞直径小，
（2）在 FSC-SSC 图上出现的不是一群比较集中的细胞群，而是分布比较散的细胞群（图 A），这与培养的细胞单细胞悬液完全不同，培养的细胞在 FSC-SSC 图上细胞的比例 80% 以上，这里主要因为成年的小鼠脑细胞有很多异质细胞，但是精确检测活/死细胞比率需要明显区分碎片和细胞群体。因为完整的脑细胞都含有细胞核，可以通过核染料来区分碎片和细胞群体，大多数核染料例如 DAPI 不能透过细胞，适用的核染料有 Hoechst 33258 和 DRAQ5，相比于 Hoechst 33258（352 nm 处的最大激发），DRAQ5（646 nm 处的最大激发）能够更好地区分细胞碎片荧光与细胞群。研究者在消化液中加入 Hoechst 33258 或 DRAQ5，消化同时染色 30 min，把核染料应用到 HEK293 的单细胞悬浮液，结果显示细胞与碎片的明显分离，这表明同类型的细胞通过核染料基于 FSC/SSC 的门控能实现明显分群（图 A）。

这个研究结果证实了成人脑细胞异质细胞的光谱特别宽，不能按照常规的方法进行 FSC/SSC 设门，因为细胞群和碎片重叠性比较高，需要先借助核染料区分碎片和细胞群。

基于核染料可以明显地把碎片和细胞群体区分，并能精确计算活/死细胞比率，研究者对实验方案进行多参数分析包括影响细胞活性的振动切片，机械研磨，以及人为因素（图 A）。把经过木瓜蛋白酶消化后的三种不同厚度的前脑半球（300,500,800 μm）分配给三个研究者，所有人使用相同的研磨方案，在 2 ml HABG 培养基中分别用大小不同的针 (ID 0.96, 0.81,0.58, 0.3 mm) 重复研磨 10 次，消化完成后弃掉木瓜蛋白酶。需要注意尽量避免注射器产生泡沫，并始终保持针尖浸入细胞悬液中以避免吸入气泡。用 ID 0.81 mm 和 ID 0.58 mm 针研磨后剩余的组织沉降至少 2 min，收集 HABG 培养基上层 1 ml 溶液，通过 45 μm 细胞过滤器过滤，补充 1 ml 新鲜的 HABG 培养基继续研磨。

通过流式细胞术分析单细胞比例和活细胞相关的参数（切片厚度，研究者操作经验），确定了脑切片厚度是主要的影响因素（图 B-D）。不同厚度的切片，单细胞比例和活细胞比例存在显著差异，较薄的脑切片产量最高（图 E、F，ANOVA p 分别为 0.0103 和 0.02）。尽管涉及到手动研磨步骤，但是人为因素不是主要影响。为了评估方案中每步研磨的影响，研究者重复实验，比较每次研磨细胞悬浮液中碎片的比例，分别使用不同大小的针研磨（ID 0.81,0.58 和 0.3 mm）。结果再次证实了切片厚度确实是影响单细胞比例和活细胞的关键性因素（Sup B、C，ANOVA 分别为 p = 0.0095 和 p = 0.03）。

该研究结果确定了在成年啮齿动物大脑单细胞分离过程中振动切片和脑部切片厚度是优化细胞活力的关键步骤。

接下来评估密度梯度离心除去碎片和富集细胞群的效果，虽然这一步使整个实验步骤增加了 30 min，但是它为稀少细胞的分选提供了很大的帮助，因为它提高了自动化细胞分选的速度和准确性，细胞富集可以减少碎片即是减少冲突事件和电子噪音，提高了分选效率。研究者应用了之前富集海马锥体神经元的方法来验证密度梯度离心的实用性。通过流式定量密度梯度处理过的样本和原始细胞悬液的细胞/碎片比率，发现前者的比例更高（ANOVA p = 0.0077）。但是在显微镜下发现了更小的细胞群，密度梯度离心去除碎片可能会丢失这群细胞。因此如果是检测未知细胞类型或特别小的细胞，建议优化或不使用梯度离心步骤。另外研究结果进一步表明脑切片厚度同样会影响密度梯度离心碎片清除的效果，可能是不同颗粒大小受原始材料的厚度影响。

该方案使用 ACSF 配制 1 mg/ml 链霉蛋白酶，在室温下消化脑切片 70 min，由于目前还不确定酶的消化效果是否取决于组织成分，例如灰质和白质的比例，在这个实验中研究者比较了三大脑区，前脑，腹中脑和部分脑肌的消化情况（图 H）。流式细胞术 DAPI 检测结果显示相比于链霉蛋白酶，木瓜蛋白酶处理的组织完整的细胞数增加（图 I 和 Sup E，ANOVA penzyme = 0.001），三大脑区没有显著区别（pregion = 0.7726）。这一发现表明了木瓜蛋白酶对成年啮齿动物的大脑组织温和解离的优越性。

小结

该研究结果有助于把从成人脑组织中分离单细胞的重要步骤标准化，从而增加数据的可比性。此外，研究者的数据通过已确定的标记基因在新的分辨率上重新定义 MSN，解决了先前基因表达研究的差异性问题同时确认了重要细胞类型中的新型亚型特异性标记基因。

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Reference
1.Ho H, De Both M, Siniard A, et al. A guide tosingle-cell transcriptomics in adult rodent brain: the medium spiny neurontranscriptome revisited[J]. Frontiers in cellular neuroscience, 2018, 12: 159.

本文产品仅供研究使用，不可用于临床诊断与治疗。

图片来源：索尼生物

编辑： z翟某某    来源：丁香园