AQs for GelRed＆GelGreen

核心问题：

Q：关于一些客户，在预制琼脂糖凝胶中跑电泳时，marker 条带跑不开，不清晰，分辨率低， 拖尾等现象的解决方案。
A：基本点 :

1. 拖带现象产生的一般原因：样品上样量过，marker 量过多。

2. Marker 分辨率低的主要原因：

marker 的加样量：marker 有一个推荐浓度范围，选择最高的，样品与 Marker 含量差别大， 也会造成条带错误（这不会是染料的问题，用 EB 也会存在该问 题）。 正确的 DNA 上样量是条带清晰的保证。Marker 应该选择在目标片段大 小附近的梯带较密的，这样比对才准确。另外注意的是，Marker 的电泳条件也 要符合 DNA 电泳的操作标准：  如果选择λDNA/EcoR I 的酶切 marker，需要预先65℃加热 5min，冰上冷却后使用。从而避免 Hind  Ⅲ或 EcoR I 酶切造成的粘性 接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象。

凝胶不平整： 梳子不干净（有污染），加样孔不平整也会影响图的效果；电泳条件： 电压不稳，电泳时间不超过 1h。电压过高，会导致小片段跑出胶， 出现条带缺失现象。

缓冲液： TBE 的缓冲能力更强，如果缓冲液缓冲性能下降，会导致 DNA 电泳 条带模糊，不规则迁移等。TAE 建议换成 TBE 效果更好。另外建议配胶时的缓 冲液和电泳缓冲液是同时配制。

染色剂： GelRed （312nm 激发 UV 成像）无毒，性价比高，灵敏度比传统 EB 高 10 倍以上，注意观察凝胶时应根据染料不同，使用合适的光源和激发波长， 如果激发波长不对，条带出现模糊等情况。

PS：小片段的 DNA 样本，选择浓度百分比大点的 gel；但是大浓度的胶对于分子大小相近的DNA 条带不易分辨，容易造成条带缺失现象；大片段的 DNA 样本，则选浓度百分比小点的 gel，这样跑出的图分辨率高。

Marker 跑不开： 凝胶的浓度适当调低；电泳时间延长；电压稍微调高点。

美国技术的答案：

Why am I seeing smeared or smiling DNA band（s） or discrepant DNA migrationMany customers use GelRed precast gels for convenience. However, because GelRed andGelGreen are high affinity dyes designed to be larger dyes to improve their safety, they can affect the migration of DNA in precast gels. Some samples, such as restriction digested DNA may migrate abnormally in GelRed precast gels. The following modifications may improve band resolution in precast gels.

1.Reduce the amount of DNA loaded. Smearing and smiling is often caused by overloadingof DNA. The recommended loading amount for ladders and samples of known concentration is 50-200 ng/lane. For samples of unknown concentration, try loading one half or one third of the usual amount of DNA.

2.Pour a lower percentage agarose gel. Higher molecular weight DNA separates betterwith a lower percentage gel.

3.Change the running buffer. TBE buffer has a higher buffering capacity than TAE buffer.

4.To avoid any interference the dye may have on DNA migration, we recommend using the post-staining protocol. If your application requires loading more than the recommended amount of DNA, use the post-staining protocol.

经过比对多家的 maker 产品，证实 Invitrogen's 1kb Plus DNA Ladder  与 GelRed 匹配度最好。

GelRed 比 EB 分子大（也是由于大分子特性，所以不会透过细胞膜进入人体产生伤害，染 料的结合原理都是一样的）。大分子的染料在预制胶中对 DNA 的迁移有一定影响，但是不确 定对那种类型的 DNA 迁移影响严重。采用后染法，不会破坏胶中的 DNA 样本，保证了 DNA 迁移的真实水平。不同于 EB，你不用再对染后的胶进行脱色。

针对预制胶电泳拖带、不清晰的建议：

1. 鉴于 GelRed 的高灵敏性，建议减少 DNA 的上样量。

2. 建议把 GelRed 再稀释一倍后使用，但过低会影响结果的灵敏性。

3. 用 1XTBE 缓冲液代替 TAE，因为含硼酸盐的试剂导电性能更好。

简单总结一句：如果您不想改变现有的实验条件，那就请采用电泳后染色吧！

GelRed＆GelGreen 常见问题：

Q：污染或微笑的 DNA 条带或错误的 DNA 迁移条带？
A：许多客户为方便使用 GelRed 预制凝胶。但 GelRed 和 GelGreen 是为安全而设计的分子 量较大的高效亲和型染料，在预制凝胶电泳中它们可以影响 DNA 的迁移。如一些限制性酶 切的 DNA 样本，可能会在 GelRed 预制凝胶中异常迁移。下列建议可能会提高预制凝胶中的 条带分离效果。

1. 减少 DNA 上样量。污染和微笑条带往往是过量的 DNA 样本造成的。推荐的泳道和 已知浓度的样品的上样量为 50-200ng/泳道。对于未知浓度的样品，尝试 1/2 或 1/3 的常用上样量2. 减少 GelRed 在凝胶中的总量，比如用 0.5X 的浓度来代替 1X 的浓度。

3. 制百分比浓度小的琼脂糖凝胶。高分子量的 DNA  在低百分比的琼脂糖凝胶分离效 果比较好。

4. 更换电泳缓冲液。 TBE 缓冲液比 TAE 缓冲液的效果更好。

5. 为了避免染料可能对 DNA  迁移的干扰，我们建议使用电泳后染胶。如果跑胶程序 需要的上样量超过推荐量，建议使用电泳后染色法。

Q：荧光弱，时间久染料性能降低，或使用后染法染料仍然在琼脂糖凝胶中。
A : 染料可能从溶液中沉淀。

1. 加热 GelRed 至 45 - 50℃，2min，搅拌溶解。

2. 染料在室温下储存，以避免沉淀。

Q：后染法需要去除染料的步骤吗？
A：不需要，不过高背景的结果可以考虑适当脱色步骤。

Q： GelRed 和 GelGreen 可以用来染色单链 DNA 或 RNA 吗？
A：GelRed 和 GelGreen 可用于单链 DNA 和 RNA 的染色，但 GelRed 染单链核酸效果比 GelGreen 敏感 5 倍左右。使用荧光酶标仪的滴定实验表明， GelRed 绑定单链 DNA 和 RNA 荧光信号约是结合双链 DNA 的一半左右。

Q：用那些仪器检测 GelRed 和 GelGreen？
A：GelRed 完美兼容标准（302 或 312nm）紫外透射成像仪。GelGreen 的吸光度在 250-300 nm 和吸收峰在 500 纳米左右。 GelGreen 兼容 254 nm 的紫外 透射或可见光激发的凝胶成像仪，如 Dark Reader 或 488 nm 凝胶激光扫描仪。

Q：什么样的发射滤波片适合使用 GelRed 和 GelGreen？
A：GelRed 使用溴化乙锭滤片； GelGreen 使用 SYBR Green 或黄色滤片。另外，长通道黄色 滤片可用于 GelRed 或 GelGreen。请查阅 GelRed 和 GelGreen 更多的特定波长的发射光谱。

Q：可以提前制作 GelRed / GelGreen 凝胶，储存供以后使用吗？
A：GelRed 和 GelGreen 染料是稳定的。在保证琼脂糖凝胶的完整性不会被破坏的前提下， 你可以将预制的 GelRed / GelGreen 凝胶储存供以后使用。 我们建议在 4℃避光贮存凝胶。

Q：GelRed / GelGreen 在熔化的琼脂糖中稳定么？可以将 GelRed / GelGreen 储存在熔化的 琼脂糖胶中，到用的时候在制备凝胶吗？
A：GelRed 比 GelGreen 更加稳定。但我们不建议将 GelRed 放在熔化的琼脂糖中存放几天。

Q：GelRed /GelGreen 的预制凝胶可以重复使用吗？
A：不可以，我们不建议 GelRed / GelGreen 凝胶电泳后重复使用，因为连续电泳会减少染 色强度。

Q：可以重新融化 GelRed / GelGreen 凝胶，再制备吗？
A： 是的，但最好再添加一些染料，保证重新制备凝胶的信号强度。

Q：GelRed 和 GelGreen 用后应该如何处置？
A： GelRed 和 GelGreen 通过 EPA 环保监管局 22 个指标测试。GelRed 和 GelGreen 已经被相 关部门批准，可以直接倾倒入下水道。然而，由于地方规定的差异，您可以请联系您当地的 安全监管部门，获取相关条例。详情请查阅 GelRed / GelGreen 安全报告信息。

Q：GelRed 及 GelGreen 与如克隆，连接和测序的下游扩增子兼容吗？
A：可以。我们建议使用 Qiagen 公司或 Zymoclean 凝胶提取试剂盒，EXO-SAP 方案，或酚氯 仿抽提法去除 DNA 中的染料成分。由于 GelRed/GelGreen 与 DNA 结合比 EB 更为紧密，所以 需要去除样品 DNA 中的 GelRed/GelGreen 染料，保证 DNA 的后续操作。

Q：GelRed / GelGreen 安全性如何？
A：GelRed/ GelGreen 经过埃姆斯 AMS 和相关测试，已经被证明是替代 EB 和 SYBR 染料更为 安全的产品。不过，请使用这些试剂时，也要遵循实验室安全条例等。

Q：哪里可以找到 GelRed / GelGreen 安全性相关信息？
A：请访问我们的网站下载完整的安全报告。

Q：GelRed / GelGreen 检测下限是什么？
A：GelRed/ GelGreen 是超敏感的染料。有些用户反馈可以检测含量＜0.1ng 的 DNA。然而， 染色的灵敏度取决于仪器的性能和曝光设置等。

Q：GelRed / GelGreen 的结合机制是什么？
A：GelRed/ GelGreen 作用原理通过静电及电荷相互作用的结合。

Q：GelRed / GelGreen 迁移的方向？
A：GelRed 和 GelGreen 相比于 EB 来说，不容易通过凝胶迁移。不需要在电泳缓冲液中添加 额外的染料，凝胶也会比 EB 染色更均匀。

Q：GelRed/ GelGreen 需要在黑暗中使用吗？
A：GelRed 和 GelGreen 是稳定的染料。你可以在室内光线下使用。然而，我们建议将染料 储存于黑暗中。

Q：GelRed / GelGreen 的使用量？
A：10,000×储备液用于 1X 预制凝胶使用量 1:1000（0比例用于电泳后染色（15 uL  用于 50 mL 溶液）。例如，5 uL  用于 50ml 凝胶），或 1:3333

Q：GelRed / GelGreen 电泳后染色可重复使用吗？
A：可以。但，如果敏感度降低，则建议更换新鲜的染料溶液。

Q：GelRed 可以被用于凝胶迁移电泳分析和脉冲凝胶电泳吗？
A：可以。GelRed 可用于 EMSA 和 PFGE 凝胶的电泳后染色。

Q：GelRed / GelGreen 可以被用于 Southern 或 Northern 杂交吗？它会干扰转膜或杂交过程 吗？
A：GelRed  可被用于 Southern 杂交（植物细胞报告 DOI：10.1007/s00299-011-1150-7）。我 们建议使用后染法。

Q：GelRed 可以被用于基于甲醛的 RNA 凝胶中？
A：可以。

Q：GelRed 可以被用于聚丙烯酰胺，DGGE 技术，EMSA 实验或 PFGE（脉冲场）凝胶吗？
A：可以。请使后染法。

Q：GelRed 可以被用于彗星试验（单细胞凝胶电泳测定技术，它是一种敏感单链或双链 DNA突变和破损的遗传测定方法）？
A：是。

Q：GelRed 是否用于碱性凝胶电泳缓冲液（30MM 的 NaOH，1mM 的 EDTA）？
A：是。

Q：GelRed 可被用于氯化铯梯度纯化的 DNA 染色吗？
A：客户使用的结果显示可以。为了去除氯化铯梯度纯化的 DNA 中的 GelRed，我们建议正 丁醇萃取前添加 SDS 至终浓度 0.1％。

Q：建议用什么方案去除电泳后胶中的 GelGreen / GelRed 染料？
A：客户报告中 提到使用  Zymo  Research  公司的  ZymoClean  凝胶  DNA  回收试剂盒 ， USB/Affymetrix  公司的 ExoSap-It  试剂盒、Sigma 的 GenElute 琼脂糖柱。Life Technologies  公 司的 PureLink 快速凝胶回收试剂盒，GE Healthcare 公司的 Illustra GFX PCR DNA  和 凝胶条带 纯化试剂盒、Roche  应用科学公司的高纯度 PCR 产物纯化试剂盒。

Q：为什么有 GelRed 和 GelGreen 两种溶剂（二甲基亚砜 DMSO 和水）？在 DMSO 和水中的 染料是否存在差异？
A：水溶解的产品相对于储存在 DMSO 中，是一个全新的改良。由于 DMSO 会被皮肤吸收， 我们建议染料溶于水，以避免处理二甲基亚砜存在的潜在危害。鉴于有些用户不希望改变实 验方案，我们将继续提供储存在 DMSO 的染料。经过内部测试，两种溶剂方案的效果相似。

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编辑： qimx    来源：丁香园