实验步骤对比

RTCA技术细胞增殖及毒性检测实验步骤：

1、向E-Plate检测板中加入培养基并测定背景阻抗值。

2、收集对数期细胞并计数，调整细胞悬液浓度，向E-Plate检测板中加入一定体积的细胞，室温超净台内放置30min。

3、将加入细胞的E-Plate检测板放入检测台上（检测台预先放入培养箱中），进行实时动态的细胞增殖检测。

4、过夜检测后，向各培养孔中加入配制好的梯度药物并继续进行实时动态检测， 即可获得化合物介导的细胞效应曲线及不同时间段IC50值。

RTCA实时无标记技术细胞增殖及毒性检测实验流程：

特点：

1、实验操作简单，步骤少，人为误差小。

2、采用无标记方法，不存在标记效率问题，并且对细胞无损伤，细胞在最接近生理状态下进行检测，结果准确度高。

3、实验结果客观，重复性好，不需设置重复孔（实验操作需规范，如有特殊要求也可设置重复孔）。

4、因预先对基础阻抗值测定，所以无需设置空白对照孔。

5、完整细胞效应图谱，提供大量、重要的动态反应信息。

MTT实验步骤：

1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度至1000-10000个/孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。

2、5%CO₂，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）。

3、加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药。一般5-7个梯度，每孔100ul，设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况。

4、5% CO₂，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

5、每孔加入20ul MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

6、终止培养，小心吸去孔内培养液。

7、每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

8、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。
 

编辑： gaowei2010    来源：丁香园