融合蛋白纯化的程序

1、实验试剂及仪器

试剂：NI-IDA 琼脂糖凝、GST 琼脂糖凝胶、层析柱、氯化钠、咪唑、 Triton X-100、1*PBS 、Tris-Hcl(PH 8.0) 、EDTA(PH 8.0)、DTT、谷胱甘肽（还原型）、20% 乙醇、3*SDS 上样缓冲液、12% 分离胶、5% 浓缩胶、10% 过硫酸铵、TEMED、1*SDS-PAGE 电泳缓冲液、乙醇、乙酸、考马斯亮蓝（R250）

仪器：恒流泵、电泳槽、电泳仪、脱色摇床、凝胶成像系统

2、操作流程：

2.1 His-tag 纯化

试剂准备：buffer 0（咪唑 0 mM）、buffer 1(咪唑 20 mM)、buffer 2(咪唑 100 mM)、buffer3(咪唑 200 mM)、buffer 4(咪唑 300 mM)、buffer 5(咪唑 500 mM)

取 2 ml NI-IDA 琼脂糖于层析柱中，连接恒流泵，自然沉淀后加入 20 ml DDH20 除去保护液

1）平衡 加入 30 ml buffer 0 平衡内环境

2）上样 样品中加入 2.1 g 氯化钠和 500 微升 Triton X-100 定容到 100 ml 流速 1.3-1.6

3）洗脱 依次加入 buffer1-5，流速 0.5-0.7。每个 buffer 收集 12 ml

4）样品处理 将收集的样品和流穿液的依次通过 SDS-PAGE 电泳，确定蛋白在哪个咪唑浓度下被洗脱

5）再生 用 EDTA 螯合金属镍离子，然后共价耦联结合 Ni²⁺，保存在 20% 乙醇溶液中

2.2 GST-Tag 纯化

试剂准备：Buffer A(50 mM TRIS-HCL PH8.0 5 mM DTT)、Buffer B(100 mM TRIS-HCL PH8.0 20 mM 谷胱甘肽)

装柱：取 2 ml GST 琼脂糖于层析柱中，连接恒流泵，自然沉淀后加入 20 ml DDH20 除去保护液

1）平衡 加入 40 ml buffer A 平衡内环境

2）上样 样品中加入 1/25 体积的 TRIS-HCL PH8.0 流速 1.3-1.6，过柱

3）两遍

4）WASH 加入 30 ml buffer A 洗脱非特异性蛋白及吸附杂质

5）洗脱 加入 BUFFER B 流速 0.5-0.7, 收集 8 管，每管 2 ml 共 16 ml。

6）再生 加入过量 BUFFER B 洗脱后，依次加入 8M 尿素再生，纯净水，最后保存在 20% 乙醇溶液中

7）将收集的 1-8 管及流穿液分别 SDS-PAGE 电泳，染色脱色后，确定纯化是否完全，以及蛋白洗脱纯度

8）选取纯度较高，浓度较大的几管进行透析，SDS-PAGE 电泳确定蛋白浓度

注意事项：

• 纯化过程中琼脂糖保持在液体环境中，切忌抽干

• 上样及洗脱流速不可过快

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编辑： zhuq    来源：丁香园