蛋白纯化流程

实验试剂及仪器

试剂：GST 琼脂糖凝胶、层析柱、Triton X-100、1*PBS 、Tris-Hcl(pH 8.0) 、EDTA(pH 8.0)、DTT、谷胱甘肽（还原型）、20% 乙醇、3*SDS 上样缓冲液、12% 分离胶、5% 浓缩胶、10% 过硫酸铵、TEMED、1*SDS-PAGE 电泳缓冲液、乙醇、乙酸、考马斯亮蓝（R250）

仪器：恒流泵、电泳槽、电泳仪、脱色摇床、凝胶成像系统

GST-Tag 纯化

试剂准备：Buffer A(50 mM TRIS-HCL pH8.0 5 mM DTT)、 Buffer B(100 mM TRIS-HCL pH8.0 20 mM 谷胱甘肽)

1、装柱：往纯化柱中加入约 2 mL 填料（固体体积），连接恒流泵，自然沉淀后用 50 mL 去离子水洗去乙

醇（商品化填料用 20% 乙醇保存）控制流速为 3 ml/min，流出液体。

2、用 30 mL Buffer A 平衡基质，控制流速为 3 ml/min，流出液体。

3、将破菌离心后的上清（低温 4℃ 保存）与基质在 50 ml 离心管中混合，4℃ 条件下，在混合培养器上结合 30~60 min，将结合后的液体加入到预装柱中，控制流速为 3 ml/min，流出液体，收集流穿液。

4、加入 50 mL Buffer A 洗去杂蛋白，控制流速为 2 ml/min，流出液体，收集流穿液。

5、加入 Buffer B，用 20 ml Buffer B 洗脱目的蛋白，控制流速为 1.5 ml/min，取 10 ml 离心管收集洗脱液 15-20 ml。

6、加入 15~20 mL Buffer B 洗去基质中残留的蛋白，然后用 100 mL 纯水清洗纯化柱，控制流速为 3 ml/min，流出液体。

7、用 20% 乙醇保存柱子，于 4℃ 冰箱中保存。

8、SDS-PAGE 电泳确定蛋白浓度。

注意事项：

• 在处理基质的所有过程中，要求液体不能流干，混合动作温和，基质中不得有气泡存在。

• 上样前，样品需离心或用滤膜过滤。如果样品太过粘稠，用 pH8.0 的 PBS 稀释，以防堵塞柱子。

• 样品过渡裂解会引起蛋白变性，降低结合载量，采用温和的裂解方法，增加结合载量。

• GST 融合蛋白与还原型谷胱甘肽的结合比较缓慢，需要控制上样和洗脱时流速（上样不高于 3 mL/min，洗脱不高于 1.5 mL/min），让其有足够的吸附和分离时间，以便达到最大的结合载量。蛋白的性质、pH、温度等也会影响蛋白的结合载量。

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编辑： zhuq    来源：丁香园