成品抗体检测程序

1、样品制备

1）细胞样品制备：

对于贴壁细胞，倒掉培养液，PBS 洗 2 次；对于悬浮细胞，先 1000 转/min 离心 5 分钟收集细胞，用 PBS 轻轻吹打重悬，再次离心。按照十的七次方数量细胞加入 1 ml 裂解液，使用前 5 分钟加入 100x 的 pmsf 和 50x 的 cocktail。冰上裂解 15 min，最后收集裂解液，4 度 13000 转/min 离心 5 min，取上清至预冷的离心管内，若有测浓度需要，则可取 10u_l 出来，剩余的裂解液，加入 3xsds 上样缓冲液，95 度加热 5 min。待上样或负 20 度分装保存。

2）组织样品制备：

新鲜的组织样品，剪碎，置于已经放在碎冰中预冷的玻璃匀浆器，按照 1:10～1:20 加裂解液（例如 100 mg 肝脏组织加入 1 ml 裂解液），裂解液在使用前 5 min 加入 100x 的 pmsf 和 50x 的 cocktail。多次匀浆，直至组织完全匀浆，收集匀浆液，置于预冷的离心管中，裂解 10～15 min，4 度 13000 转/min 离心 5 min，取上清至预冷的离心管内，若有测浓度需要，则可取 10u_l 出来，剩余的裂解液，加入 3xsds 上样缓冲液，95 度加热 5 min。待上样或负 20 度分装保存。

2、制胶

1）根据目的蛋白分子量的大小选择合适的分离胶浓度

2）小型的垂直电泳槽，对于 1 mm 的玻璃板，分离胶灌 4.5 ml，加入异丙醇封胶，约 30 min 后，分离胶凝固，到掉异丙醇，灌入浓缩胶 1 ml，插上梳子。凝固 1～2 h 后使用。

3、电泳

电泳采用恒压模式，浓缩胶 80v，约 25 min 后进入分离胶，调至 120v，溴酚蓝跑至分离胶底部时，终止电泳。

4、转膜

1）使用 PVDF 膜，将膜裁至合适大小，放入甲醇中，5 秒，ddH₂O 洗三次，置于转膜液中平衡，待用。

2）电泳结束后，到掉电泳液，取出玻璃板，将凝胶取出，制作黑色塑料面-海绵-滤纸-凝胶膜-滤纸-海绵」三明治」, 固定好后，放入转移槽，凝胶位于负极（黑色面），膜位于正极，采用恒流（电压最大，电流 300mA），在冰水浴中转移。电流以及转移时间按照目的蛋白分子量来定。

5、免疫反应

1）封闭：转膜成功后，应在膜上可观察到清晰 marker 条带，将膜置于 5% 脱脂牛奶/PBST 中，室温，摇床 45 min。

2）一抗：使用封闭液稀释一抗，稀释比例应具体摸索。到掉封闭液，加入一抗稀释液，室温，摇床 1 h（或者 4 度过夜）。

3）二抗：一抗孵育完毕，PBST 洗膜 5 minx4 次。使用 PBST 稀释二抗，稀释比为 1：5000。室温，摇床 30 min。二抗完毕，PBST 洗膜 5 minx4 次。待曝光。

6、曝光

1）显影液，定影液配置

2）将漂洗完成的膜置于保鲜膜上，加上 ECL 完全覆盖膜，孵育 30s，将膜包起，吸干残余 ECL，置于暗夹中，于暗室内，压片 30s 做初步曝光，胶片置于显影液中，观察条带，自来水漂洗，定影。选择最佳条件后，曝光至较佳状态后，结束曝光。

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编辑： zhuq    来源：丁香园