CDK9/CyclinT激酶检测试剂盒：现货促销，实验不断档

在肿瘤生物学研究中，转录失调是驱动癌细胞增殖和耐药的关键机制之一。CDK9（周期蛋白依赖性激酶9）作为正性转录延伸因子b（P-TEFb）复合物的催化亚基，与周期蛋白CyclinT共同调控RNA聚合酶II的C端结构域磷酸化，从而控制基因转录延伸过程。多种癌基因（如MYC、雄激素受体AR等）的转录高度依赖CDK9-CyclinT复合物的活性。CDK9的过度活化与肿瘤发生及治疗耐药密切相关，因此靶向CDK9-CyclinT已成为抗癌药物开发的热点方向。近年来，除了传统小分子抑制剂，靶向蛋白降解（PROTAC）技术也取得了突破——例如选择性CDK9-CyclinT降解剂LL-K9-3在22RV1细胞中显示出比亲本抑制剂SNS032及PROTAC分子Thal-SNS032更强的降AR和cMyc效果。这些进展凸显了可靠、高效的CDK9激酶活性检测方法在药物发现中的重要性。

艾美捷代理BPS Bioscience推出的CDK9/CyclinT Kinase Assay Kit（货号：79628），正是为满足激酶抑制剂筛选和酶动力学研究需求而设计的一套完整发光法检测方案。该试剂盒采用Kinase-Glo Max作为检测试剂，通过定量反应后剩余ATP的含量来反映激酶活性，具有操作简便、灵敏度高、动态范围宽及高通量兼容等突出优势。以下从检测原理、试剂盒组分、操作流程、应用场景及性能特点等方面进行详细介绍。

 

一、检测原理：基于ATP消耗的发光法定量激酶活性

本试剂盒的核心检测原理为“激酶反应-剩余ATP检测”偶联法：

激酶反应：在含有重组人源CDK9/CyclinT复合物、特定激酶底物（如组蛋白或合成肽段）及ATP的反应体系中，CDK9/CyclinT催化底物磷酸化，同时将ATP转化为ADP。反应过程中ATP被持续消耗。

终止与检测：反应进行一定时间后，加入Kinase-Glo Max发光试剂。该试剂含有热稳定性荧光素酶及其底物荧光素。当体系中存在剩余ATP时，荧光素酶催化荧光素氧化产生稳定发光信号。发光强度与ATP剩余量呈正比，与激酶活性呈反比。

信号转换：在无激酶或激酶被完全抑制的情况下，ATP消耗最少，发光信号最高；反之，激酶活性越强，ATP消耗越多，发光信号越低。通过比较待测样品孔与对照孔的发光值，即可计算激酶活性或抑制率。

这一检测模式具有以下技术优势：均相（无需分离磷酸化产物）、高灵敏度（检测低至亚微摩尔ATP）、宽动态范围（超过4个数量级）以及操作简便（仅需“混合-孵育-读数”三步）。与传统放射性同位素法（如³²P-ATP掺入）相比，避免了放射性危害和废料处理问题；与荧光法相比，无需激发光源，不受化合物自发荧光干扰。

 

二、试剂盒组分与规格

该试剂盒提供两种规格：96孔板形式（100次反应）和384孔板形式（400次反应），每个试剂盒包含以下核心组分：

重组人CDK9/CyclinT激酶：纯化的活性复合物，经质控验证具有底物磷酸化活性。

激酶底物：适用于CDK9的底物，通常为含有特定丝氨酸/苏氨酸残基的合成肽段或全长蛋白。

ATP：高纯度三磷酸腺苷，浓度经标定。

激酶检测缓冲液：优化pH及离子成分，维持激酶最佳活性。

Kinase-Glo Max 发光试剂：即用型，避光保存。

详细操作说明书：包含推荐反应体系、孵育时间及数据分析方法。

 

所有组分在收货后按指示存储（通常为-80°C），自收货之日起6个月内保持最佳性能。Kinase-Glo试剂需避免反复冻融，建议分装后于-20°C避光保存。

 

三、实验流程简要说明

以下为典型96孔板单次反应的操作步骤（总体积50 uL）：

1. 试剂准备

从-80°C取出CDK9/CyclinT激酶、底物、ATP及检测缓冲液，置于冰上解冻。

平衡检测缓冲液至室温。Kinase-Glo试剂提前30分钟取出平衡至室温（避免反复加热）。

准备待测抑制剂：用DMSO或缓冲液稀释至所需浓度（建议设置10个浓度梯度，2倍或3倍倍比稀释）。注意最终DMSO浓度不得超过1%（详见禁忌说明）。

2. 激酶反应体系构建

每孔加入10 uL检测缓冲液。

加入2 uL待测抑制剂或对照（DMSO/缓冲液/阳性对照如SNS032或LL-K9-3）。

加入5 uL CDK9/CyclinT激酶（推荐起始浓度0.5–10 nM，需预实验优化至消耗30–50% ATP）。

加入10 uL激酶底物（终浓度依说明书推荐，通常为0.1–1 ug/孔）。

加入3 uL ATP（终浓度通常为10–100 uM，接近或低于Kₘ值以获得最佳抑制灵敏度）。

用检测缓冲液补足总体积至25 uL（具体体积以说明书为准）。启动反应。

3. 激酶反应孵育

用封板膜覆盖，室温或30°C孵育30–60分钟（使ATP消耗处于线性区间）。

4. 发光检测

加入25 uL Kinase-Glo Max试剂（与反应体系等体积）。

在摇床上混合1–2分钟，室温孵育10–30分钟（使发光信号稳定）。

使用发光酶标仪（读板模式：终点法，积分时间0.5–1秒）读取发光值（RLU）。

5. 数据分析

Dinaciclib抑制CDK9/CyclinT激酶活性。

 

四、应用场景

本试剂盒主要面向以下两大类核心应用：

1. 小分子激酶抑制剂的筛选与IC₅₀测定

2. 酶动力学研究

 

五、性能特点与注意事项

线性范围与Z'因子：在优化条件下（激酶消耗30–50% ATP），Z'因子通常大于0.7，满足高通量筛选对统计学可靠性的要求。信号窗口（信背比）通常>5倍。

DMSO耐受性：体系中DMSO终浓度不得超过1%（见Contraindications），否则会抑制激酶活性或干扰荧光素酶反应。建议将化合物母液浓度配制成至少100×，加入反应体系后稀释至1%以下。

ATP浓度选择：为筛选ATP竞争性抑制剂，建议使用接近或低于Kₘ的ATP浓度（如10 uM）；为评估非竞争性抑制剂或进行选择性谱分析，可使用饱和ATP浓度（如1 mM）。用户需根据研究目的调整。

反应时间优化：首次使用应进行时间进程实验，确保激酶反应在线性区间内（通常30–60分钟）。过度反应导致ATP耗尽，将无法区分抑制程度的差异。

阳性对照：建议使用已知CDK9抑制剂如SNS032、 flavopiridol或降解剂LL-K9-3作为阳性对照，验证体系性能。

化合物干扰排除：某些化合物可能抑制荧光素酶活性（“火萤光素酶抑制剂”）或淬灭发光信号。建议设置“化合物+Kinase-Glo（无激酶反应体系）”对照，评估化合物对检测试剂的直接影响。若存在干扰，需使用替代检测方法（如放射性滤膜结合法）进行交叉验证。

 

六、文献参考

Napolitano G, et al., 2003 J Cell Physiol. 197(1):1-7.

Li J., et al., 2022 J Med Chem. 65(16):11034-11057.