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荧光素酶(luciferase)是自然界中能够产生生物荧光的酶的总称。荧光素酶可以催化荧光素氧化成氧化荧光素,在荧光素氧化的过程中,会发出生物荧光。然后可以通过荧光测定仪测定荧光素氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系,可以极其灵敏、高效地检测基因的表达,是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。 目前,最有代表性的是从甲虫中分离得到的萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)和从海肾中分离得到的海肾荧光素酶(Renilla luciferase)。其中萤火虫荧光素酶作为报告基因反应目的基因表达的改变,肾荧光素酶作为内参基因,为实验提供统一基准线(减少内在变化因素如培养细胞的数目,细胞转染和裂解的效率对实验准确性的影响)。 实验原理 萤火虫荧光素酶在氧气、ATP和镁离子同时存在的条件下,催化荧光素氧化,生成氧化荧光素,同时产生黄绿色光,波长540-600nm。 应用类型 由于两种酶底物和发光颜色的区别,且在动物体内无内源性表达,使其双报告基因系统在基因调控、非编码RNA靶向互作等研究领域得到广泛应用。 启动子研究:转录因子主要通过作用于靶基因的启动子起作用,将目的基因启动子区序列替换报告基因F-Luc的启动子,通过共表达转录因子后,报告基因表达的改变,来确定转录因子与靶基因启动子结合位点及对靶基因的作用。 荧光素酶检测试剂盒(萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶由于都是非分泌型蛋白,所以在检测之前需要对过表达细胞进行裂解处理):
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