手把手带你做实验｜分子筛层析：手动操作+方法设置，一篇吃透（上）
2026-04-08 15:23点击次数：18
关键词：一、实验前准备
详见手把手带你做实验｜实验前必看！ÄKTA层析实验前准备完整流程
二、分子筛层析的手动操作
1
保存手动运行的实验结果
（关键！避免结果丢失）
很多人忽略这一步，导致实验结果被覆盖，白白浪费时间！划重点：系统默认将手动运行结果保存在「结果-Manual文件夹」，但该文件夹仅能保存10个结果，超过后会自动覆盖前序结果。
正确操作步骤：
点击工具栏Manual→Execute Manual Instructions在打开的Manual Instructions对话框中选择Save result as后的Browse按钮，选择要保存的路径及名称，点击OK。
图1 保存结果
2
层析柱平衡
2.1 设置压力报警：
点击工具栏Manual→Execute Manual Instructions→Alarm，根据层析柱参数，设置Alarm system pressure和Alarm pre column pressure（本案例均设为5 MPa），点击Insert；如有Alarm delta column pressure则根据填料耐压进行设置。
图2 设置压力报警
2.2 设置柱位与流向：
点击Flow Path→Column position，在下拉框选择柱子连接的位置；在Flow Direction复选框，选择溶液流向（一般选Down flow自上向下运行），点击Insert；如无柱位阀则无需进行设置。
图3 设置柱位和流向
2.3 设置运行流速：
点击Pumps→System flow，输入柱子推荐流速（如Superose 6 Increase 10/300推荐流速为0.5 mL/min），点击Insert→Execute。
图4 设置流速
2.4 设置监测波长：
点击Monitor→Wavelength，选择需要监测的波长，点击Insert→Execute；无需使用的波长，勾选后面的Off复选框关闭即可。（注意：单波长设备或仅需280 nm检测时，可跳过此步）。
图5 设置监测波长
2.5 平衡：
点击Execute，系统开始运行，层析柱进入平衡状态，此时Process Picture中会以绿色标识运行流路。
图6 实验运行界面
⚠️小提醒：平衡过程中，观察系统曲线，确保无异常波动，耐心等待平衡完成。
3
进样及洗脱
层析柱平衡期间，可提前准备上进工作，节省操作时间，步骤如下：
第一步：准备进样（平衡期间可同步操作）
3.1
在进样阀的LoopF和LoopE口，连接样品环(如0.5 mL)。
3.2
用注射器抽取缓冲液，连接到进样阀的Syr口，推入缓冲液清洗样品环，可重复几次，确保清洗彻底。
3.3
清洗完成后，用注射器吸取样品（重点：吸取的样品体积必须大于样品环体积）。
3.4
排除注射器内的气泡，将注射器连接到进样阀的Syr口，推入样品（重点：推入体积稍大于样品环体积，确保无气泡）。
⚠️注意：样品推完后，注射器仍需保留在进样阀上，不可取下，防止进气。
第二步：上样及洗脱操作
当系统所有曲线稳定，且电导、pH等参数符合平衡buffer条件，说明层析柱平衡完成。
3.5
点击Manual→Execute Manual Instructions→Monitors→Auto zero UV，点击Insert。
图7 紫外清零
3.6
点击Manual→Execute Manual Instructions→Flow Path→Injection valve，将进样阀选择为Inject，点击Insert。待进样完成后（根据流速和进样体积进行计算），将进样阀选择为Manual load，点击Insert，完成进样过程。
图8 插入Inject模式
3.7
点击Manual→Execute Manual Instructions→Fraction collector F9-R→Fractionation，设置Fraction size为1 ml，点击Insert。（此为固定体积收集示例）
图9 插入收集命令
3.8
点击Execute，系统开始上样及洗脱过程。
3.9
观察仪器界面，待紫外峰与电导峰均出现（走完约1.5 CV），点击工具栏中的结束图标，停止实验即可。
第三步：实验运行结束后需要清洗层析柱保存在 20%乙醇中
3.10
将缓冲液A1的入口放入去离子水中，执行Pump wash命令。点击工具栏Manual Execute Manual Instructions→Alarm, 分别设置Alarm system pressure和Alarm pre column pressure为5 MPa和5 MPa，点击Insert。
3.11
点击工具栏Manual→Execute Manual Instructions→Flow Path→Column position, 在下拉框中选择柱子需要连接的位置，在Flow Direction复选框中选择溶液流向Down flow或者是Up flow（一般选择Down Flow,自上向下运行），点击Insert；如无柱位阀则无需进行设置。
3.12
点击工具栏Manual→Execute Manual Instructions→Pumps→System flow, 输入层析柱推荐的流速为0.5 mL/min，点击Insert。
3.13
点击Execute一起执行相应的命令，即可开始用水清洗层析柱，运行2个柱体积之后，点击工具栏暂停图标，暂停。
3.14
将缓冲液A1的入口放入经脱气的20%乙醇中，继续运行，再次执行Pump wash命令。
3.15
待泵冲洗结束后，机器会自动继续之前0.5 ml/min的流速，用20%乙醇溶液清洗柱子，运行2个柱体积后，完成层析柱的保存。
