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支原体全方位检测与清除攻略

2023-09-18 15:16 点击次数：关键词：

在养细胞的过程中，总会有一些不速来客，它们总会不请自来，比如真菌、霉菌。但最令人头疼的还是支原体，它总是悄悄的来，对细胞造成极大的危害，今天就来认识一下支原体。

支原体是什么？

支原体是目前为止发现的最小的原核生物，具有以下特点：

1.形态结构与细菌相似，但又比细菌小，是介于细菌与病毒之间的微生物；

2.结构简单，只有细胞膜、细胞质、核糖体、DNA、可溶性RNA和一些其它细胞内含物，支原体的细胞器只有核糖体；

3.没有细胞壁，具有多种形态，丝状、球状、扁平状等；
4.体积小，最小的只有0.1μm，部分支原体可通过0.22μm滤器，但过滤器并不能完全去除支原体^[1]。

支原体如何危害细胞？

支原体污染一般在显微镜下不可见，很难察觉，但细胞会受到极大的损伤，主要通过以下途径影响细胞生长及功能。

支原体来自哪里？

1.污染细胞支原体的种类

污染细胞的种类有在二十种以上，其中95%以上的支原体污染是口腔支原体、精氨酸支原体、发酵支原体、莱氏无胆甾原体和猪鼻支原体五种^[2]。

2.支原体污染的来源

环境污染：如细胞培养房、细胞培养箱、超净工作台内已被支原体污染；
实验器材的污染：移液枪、移液管、细胞培养皿、水浴锅等；
细胞培养试剂的污染：培养基、胰酶、血清、细胞冻存液等；
污染的原代细胞；
操作人员操作带来的污染等；

如何预防支原体？

支原体危害这么大，我们应该如何应对？我们可以从以下几个方面预防支原体：

1.定期消毒：定期对细胞房、实验服、移液枪、细胞培养箱等进行消毒，及时清除支原体；可使用碧云天Myco-Zero™支原体去除喷雾剂，它是一种新型多肽类表面活性剂，可以快速、高效去除和预防工作区域中支原体污染，可以用于对实验台、生物安全柜、超净工作台、二氧化碳培养箱、移液器、液氮罐、门把手等实验室设备及实验室环境进行消毒，不仅可去除和预防支原体，同时也适用于广谱的抗菌消毒。不含汞、甲醛和苯.酚等刺激性物质，无腐蚀性和致癌性成分，预防或清除支原体的同时，不会对实验人员或仪器设备造成伤害，方便安全；

2.检查细胞培养试剂：选择来源可靠的试剂及耗材产品，在进行细胞培养操作之前，检查细胞培养基、血清、胰酶等试剂，可选择合适孔径的滤膜进行过滤除菌，使用过程中如发现有污染应及时更换；

3.规范细胞培养操作：建立良好的细胞培养操作SOP，遵循无菌操作原则，规范穿戴实验服、口罩、手套等，并在细胞培养开始时进行消毒；规范处理实验废弃物；

4.在培养基中加入支原体预防试剂：

加入抑制支原体DNA合成的抗生素：例如氟喹诺酮类抗生素；
加入抑制支原体蛋白质合成的抗生素：例如大环内酯类、四环素、双萜烯类等抗生素；

碧云天的4种抗生素类支原体预防去除试剂的比较和选择请参考下表：

加入非抗生素类支原体清除试剂：如膜活性多肽，通过与支原体膜特异性结合彻底清除支原体。

支原体检测方法有哪些？

1.分离培养法：

检测方法：将待检样品接种到适合支原体生长的液体培养基或固体培养基中，如有支原体污染，液体培养基颜色会改变，固体培养基将会有菌落疯狂生长^[2]。
优点：该方法被称为支原体培养法的金标准，可以检测绝大多数支原体。
缺点：支原体生长到一定数量才能判断是否有污染，检测时间长，无法实现对支原体的快速检测

2.原位染色法：

检测方法：通过染色试剂（如DAPI、Hoechst 等）对待测细胞培养物进行染色，在荧光显微镜下观察待测样品的荧光判断支原体污染。
优点：可清晰直观的看到支原体微粒。
缺点：死亡细胞释放的DNA也会被染色，在支原体轻度污染时，较难判断是否有支原体污染。

图1. 碧云天支原体染色试剂盒（C0296）检测效果图参考上图。左图为无支原体污染情况，中图为支原体轻度污染情况，箭头所指为微粒状的一些支原体，右图为支原体重度污染情况，可见大量微粒状的支原体。

3.化学发光法

检测方法：利用支原体特有酶的活性并通过ATP依赖的萤光素酶催化的发光反应进行检测，通过比较检测试剂加入前后ATP量的变化来确定样品是否有支原体污染。
优点：检测快速，仅需15min即可完成检测。
缺点：该方法只能检测活的支原体，如果支原体死亡，将无法通过ATP的变化判断支原体污染。

图2. 碧云天Myco-Lumi™发光法支原体检测试剂盒（C0298）检测数据分析。B/A比值<0.9，支原体阴性，无支原体污染；B/A比值在0.9-1.2之间，临界值，结果较可疑；B/A比值>1.2，支原体阳性，有支原体污染。

4.巢式PCR法：

检测方法：通过设计两对引物扩增支原体的DNA，第一对引物用于第一步PCR，用于初步判断是否有支原体污染；用第二对引物进行第二轮PCR，观察DNA条带用于鉴定是否有支原体污染，如图4。
优点: 通过两轮PCR可以大大提高检测的特异性和灵敏度，可根据扩增片段的大小大致预测支原体的种属。
缺点：操作繁琐，需要进行两轮PCR。

图3. 使用碧云天支原体PCR检测试剂盒（C0301S）进行PCR检测时扩增产物的琼脂糖凝胶电泳示意图。1、2、3是1st PCR产物；1#、2#、3# 是相应的2nd PCR产物。各泳道的模板分别是：1和1#，Control template；2和2#，支原体污染的细胞上清；3和3#，超纯水。

5.探针法qPCR：

检测方法：设计特异性引物和荧光探针，通过探针法qPCR高灵敏检测培养的细胞等生物材料中是否有支原体污染。
优点：灵敏度高，检测快速，可一次性检测大量样品，PCR扩增后无需电泳分析即可判断是否具有支原体污染。
缺点：该方法灵敏度很高，因此对实验环境要求较为苛刻，且需要精密的qPCR仪器。

图4. 碧云天支原体qPCR检测试剂盒(C0303)用于阳性对照和阴性对照的检测效果。左图是试剂盒中的阳性对照，右图是试剂盒中的Nuclease-free water作为阴性对照，两组对照同时添加了内参对照DNA，FAM为支原体检测信号，VIC为内参对照检测信号。左图的支原体和内对照检测曲线正常，而右图仅内参对照检测曲线正常，支原体为阴性。

6.等温扩增变色法：

检测方法：通过设计4-6对特异性引物，在一定的恒定温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物进行核酸的快速扩增，并且通过颜色变化而无需电泳分析即可确定是否有支原体污染。
优点：不需要反复的升温和降温，不需要精密的仪器，在恒定的温度下即可对核酸进行扩增。反应结束后，无需电泳分析，通过颜色变化即可判断是否具有支原体污染。
缺点：对引物要求较高，需要设计多对引物，且扩增产物不能用于测序。

图5. 碧云天BeyoColor™支原体等温扩增变色检测试剂盒(C0305)的检测效果图。

细胞被污染，怎么办？

如果细胞被支原体污染，不要着急，也不要弃掉，我们可以及时清除支原体，对细胞进行挽救，减少支原体对细胞的危害。

1.及时更换培养液：可以减缓支原体的污染，但不能完全清除；

2.使用抗生素类去除试剂：抗生素对支原体有较好的抑制作用，可以有效清除支原体，但长时间使用抗生素，会产生耐药性的风险。在使用单一抗生素清除效果不佳时，可以考虑更换抗生素或者采用复合型抗生素试剂；

3.使用非抗生素去除试剂：非抗生素清除试剂不会产生耐药性，对支原体的清除效果可以达到100%，且几乎对细胞没有影响，是去除支原体的首.选试剂。例如碧云天Myco-Zero™系列支原体去除试剂，主要成分为多肽类表面活性剂，可特异性与支原体膜结合，通过改变膜通透性从而杀死支原体，并且无须长期维持，适合各种被支原体污染的细胞、病毒及相关试剂的处理，特别适合被支原体污染的珍贵细胞或已污染支原体但需要保种细胞的支原体去除。该产品不会改变细胞的任何特性，可放心使用。

图6. 碧云天Myco-Zero™ Plus支原体去除试剂(C0285)对支原体阳性细胞的作用效果。图A为对贴壁的HeLa细胞的支原体去除效果，图B为对悬浮的MOLM-13细胞的支原体去除效果。

图7. 碧云天非抗生素类Myco-Zero™ Plus支原体去除试剂(C0285)与抗生素类支原体清除试剂(C0288)、支原体清除试剂Plus (C0290)、支原体预防去除试剂I (C0292)、支原体预防去除试剂II (C0293)对支原体阳性的HeLa细胞去除支原体的效果图。

4.实验室环境清洁

发生支原体污染后，应及时处理已被污染的细胞，并对细胞房进行彻底的清洁和消杀，防止交叉污染。在对实验室环境进行清洁时，推荐使用前面提到的Myco-Zero™支原体去除喷雾剂，适用范围广，且在抗菌消毒的同时，不会对工作台等设备表面产生损伤。

针对支原体污染，碧云天提供一系列检测试剂盒以及支原体预防和清除试剂

细胞培养过程中细菌和真菌污染其实也是很令人头疼的事情。除了在培养液中添加一定比例的抗生素外，也建议大家定期对细胞房、培养箱进行清洁除菌。碧云天可提供BeyoClean™系列细胞房除菌剂和培养箱除菌剂，二者分别用于细胞房、实验室和CO₂培养箱、生物安全柜、超净工作台中病毒、细菌、真菌、支原体、霉菌等微生物的抑制和清除，保持环境洁净，有效防止细胞的污染，并且产品对影响细胞培养的各类细菌、真菌、支原体等微生物均有清除的效果，尤其对暴露在空气中的细菌、真菌及其芽孢和孢子抑制效果可长达7-10天，多次使用即可清除。
此外还有BeyoClean™水浴锅抑菌剂(500X)和BeyoClean™细胞培养箱用水抑菌剂(500X)，二者可分别用于细胞培养箱或水浴锅内水体细菌、真菌、支原体、藻类等微生物的抑制和清除，维持水体洁净，避免交叉污染。使用效果可媲美国外同类产品，且极少产生耐药性！
各类产品搭配使用，细胞培养更安心哦！