一、mRNA 疫苗/药物工作原理 随着新冠病毒的全球流行,mRNA 疫苗/药物的开发引起了全球范围内广泛的关注。其中 mRNA 技术作为药物开发的新平台展现出了优异的作用。通常,体外转录合成的 mRNA 在经过脂质载体的包被后能够被细胞通过胞吞作用摄入到体内,随后脂质载体中的 mRNA 被释放,进一步的进行翻译,行使药物相关功能。mRNA 技术作为新型的药物开发平台,以其简洁的作用原理和更简单的制造工艺能够极快的加速药物的开发周期,同时,更加精准的机制描绘了不同背景下的广阔应用。 图 1 mRNA 药物的工作原理 二、mRNA 疫苗/药物 的应用范围 mRNA 疫苗/药物的开发机理非常明确,目前已经广泛的应用在以下药物开发工作中,包括: (1)新冠疫苗和传染病疫苗的开发; (2)抗肿瘤 mRNA 药物; (3)mRNA 抗体替代疗法; (4)基因编辑药物开发; (5)细胞治疗药物的开发等。 图 2 mRNA 药物的工作原理 三、 mRNA 药物/疫苗的工艺流程 相比较传统的药物开发,mRNA 药物开发流程有着非常简洁的流程。获得一条性能优异的 mRNA 序列是关键的第一步,通常需要经过一系列的序列设计和验证实验来得到。随后,被转录出来的 mRNA 经过下游的纯化以后可以进行进一步脂质载体的包裹来获得药物制剂。 图 3 mRNA 药物的工艺流程 四、mRNA 基本结构 图 4 mRNA 的基本构造和功能 一条体外合成的 mRNA 完整的序列应当包括: (1)5’-Cap,通常作为 mRNA 的起始结构,帽子结构可以使得 mRNA 进入体内以后开始翻译,并维持 mRNA 的稳定性; (2)5’-UTR,可以提高 mRNA 在体内翻译的效率; (3)CDS 区域,不同物种的 CDS 有一定的偏好性,因此,对 CDS 区域进行广泛的筛选和设计显得尤为关键,不仅可以提高 mRNA 的翻译效率,同时修饰碱基的使用,可以进一步的降低 mRNA 在体内的免疫原性,增强药物表现; (4)3’-UTR,可以提高 mRNA 的翻译效率; (5)Poly-A tail,进一步提高 mRNA 的稳定性,提高 mRNA 的翻译效率。 以上元件基本构成了成熟的 mRNA,筛选出性能优越的 mRNA,则是开发 mRNA 药物的基础工作。需要注意的是,当所设计的 mRNA 药物为分泌型,则需要进一步考虑信号肽的筛选问题。 五 体外转录 mRNA 的相关原料 1.合成帽子结构 化学共转录法加帽是目前 mRNA 药物开发的主流方法,通过一步法在 IVT 反应中进行加帽,能够使得后续开发过程的体外转录工艺放大变得尤为简单。常见的加帽结构有以下三种: (1)Abs Cap AG 是专为化学法体外转录合成 mRNA 设计的加帽试剂。通过有机化学合成,复刻天然 mRNA 帽子中的甲基化结构,从而合成与天然 Cap 1 mRNA 结构一致的 mRNA 产品。有赖于化学合成天然拥有的结构一致性与高甲基化效率(>95%),Abs Cap AG(abs60182)合成的 mRNA 将比 Cap0 mRNA 或者上一代 Cap 类似物(ARCA)拥有明显的效率优势。 (2)Abs Cap AU (abs60184)是专为化学法体外转录合成 mRNA 设计的加帽试剂。通过有机化学合成,复刻天然 mRNA 帽子中的甲基化结构,从而合成与天然 Cap 1 mRNA 结构一致的 mRNA 产品。有赖于化学合成天然拥有的结构一致性与高甲基化效率(>95%),Abs Cap AU (abs60184) 为自复制 mRNA 特别设计,适合诸如 Venezuelan equine encephalitis virus (VEEV), Semliki forest virus (SFV) 和 Sindbis virus (SIN) 的正链 RNA。合成的 5’端 AU 开头的 mRNA将比Cap0 mRNA 或者上一代 Cap 类似物(ARCA)拥有明显的效率优势。 (3)Abs Cap GG (abs60183)是专为化学法体外转录合成 mRNA 设计的加帽试剂。通过有机化学合成,复刻天然 mRNA 帽子中的甲基化结构,从而合成与天然 Cap 1 mRNA 结构一致的 mRNA 产品。Abs Cap GG (abs60183)比 Cap0 mRNA 或者上一代 Cap 类似物(ARCA)拥有明显的效率优势。 2.修饰碱基 mRNA 的免疫原性会使得药物进入体内以后引发较为剧烈的免疫反应,因此,需要引入不同的碱基修饰来降低 mRNA 药物的免疫原性,常见的修饰碱基有以下几种: (1)N1-甲基-假尿苷是目前商业化疫苗中最常用的修饰核苷。与含尿苷的未修饰 mRNA 相比,N1-甲基-假尿苷修饰 mRNA 的应用表现出更好的核酸酶稳定性、免疫原性和翻译特性,目前广泛应用于 mRNA 疫苗和药物开发中。 (2)假尿苷是最常用的修饰核苷之一。与含尿苷的未修饰 mRNA 相比,假尿苷修饰 mRNA 的应用表现出更好的核酸酶稳定性、免疫原性和翻译特性。因此,假尿苷可以通过修饰碱基取代标准碱基来开发性质改善的可制药 mRNA。 (3)5-甲氧基-UTP 是自然发生尿苷三磷酸(UTP)的类似物。与 N1-甲基假尿苷和假尿苷修饰相似,5-甲氧基尿苷是另一种常用的化学修饰,用于 mRNA 体外合成,以提高 mRNA 活性和减少先天免疫反应。 (4)5-甲基-CTP 是一种修饰核苷三磷酸,在体外合成中常用来替代天然的胞苷三磷酸(CTP)。加入化学修饰的 5-甲基-CTP 可以提高 mRNA 的稳定性和蛋白表达,同时减少先天免疫受体与体外转录(IVT) mRNA 的相互作用。 (5)m6A 是 ATP 的类似物,为一种常用的化学修饰,是大多数真核生物中 mRNA 和长链非编码 RNA 最丰富的内部修饰。m6A 用于 mRNA 体外合成,可以提高 mRNA 活性和减少先天免疫反应。 图 4 mRNA 的基本构造和功能 3.体内天然帽子结构 人体内天然存在 Cap1 型,Cap2 型帽结构,2018 年由 Shinichiro Akichikade 等人发表在 Science 文章中发现在 mRNA 5'-帽结构中上含有 92% 的 m6Am 和 8% 的 Am,促进 mRNA 的翻译,因此证明了体内天然存在 Cap1 型 AG/ m6AG ,Cap2 型 AG m6AG 四种类型的帽结构,由此影响了体内 mRNA 的生物学功能。Wei J 和 Mauer J 等研究也发现存在 m6Am 帽修饰的 RNA 拥有更高的稳定性。 Abs Cap AG/Abs Cap2 AG/Abs Cap m6AG/Abs Cap2 m6AG 是专为化学法体外转录合成 mRNA 设计的加帽试剂。 通过有机化学合成,复刻体内天然存在的 mRNA 帽子中的甲基化结构。这 4 种复刻天然帽结构的类似物作为研究组合,可供科学家们在 mRNA 药物开发中研究不同的体内天然帽结构对 mRNA 功能的影响。 爱必信(absin)可以提供优质的 mRNA 原料(以下是部分产品):
货号 |
名称 |
规格 |
abs60166 |
2 氧甲基转移酶 2´-O-Methyltransferase |
2500U/10000U/50000U |
abs60171 |
BsaⅠ限制性内切酶 |
1KU/5KU/10KU |
abs60153 |
T7 RNA 聚合酶 |
50KU/200KU/1000KU |
abs60152 |
牛痘病毒加帽酶/Vaccinia Virus Capping Enzyme |
500U/2000U/10000U |
abs60172 |
脱氧核糖核酸酶Ⅰ/DNase Ⅰ |
500U/2000U/10000U |
abs60170 |
无机焦磷酸酶/Pyrophosphatase,Inorganic(0.1U/nL) |
10U/50U/100U |
货号 |
名称 |
规格 |
abs60188 |
5-甲氧基-CTP锂盐溶液 |
10μL/50μL/1mL |
abs60159 |
ATP Sodium salt solution(100 mM) |
1ml×3 |
abs60186 |
N1-甲基-假尿苷三磷酸四锂盐溶液/N1-Methyl-Pseudo-UTP |
10ul/50ul/1mL |
abs60187 |
N6-甲基-ATP锂盐溶液 |
10ul/50ul |
abs60158 |
NTP 钠盐混合溶液(含ATP、CTP、GTP、UTP) |
1ml×3 |
abs60185 |
假尿苷三磷酸四锂盐溶液/Pseudo-UTP, lithium salt solution |
10ul/50ul/1ml |
工具 mRNA 目录:
序号 |
名称 |
规格 |
产品特征 |
abs60176 |
EGFP mRNA |
100ug |
新鲜现货 |
abs60195 |
mBanana mRNA |
100ug |
新鲜现货 |
abs60198 |
mOrange mRNA |
100ug |
新鲜现货 |
abs60312 |
OVA mRNA |
100ug |
新鲜现货 |
abs60313 |
tdTomato mRNA |
100ug |
新鲜现货 |
abs60315 |
β-gal mRNA |
100ug |
新鲜现货 |
备注:所有工具RNA均使用 Cap AG结构共转录加帽,修饰碱基5种可任选其一(5-Methoxy-UTP,5-Methyl-CTP,N1-Methylpseudo-UTP,N6-Methyl-ATP,Pseudo-UTP。) |
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