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实验材料: 基础培养基 血清(常规为FBS/NBS) 无菌PBS磷酸盐缓冲液 电动移液枪 移液枪 超净工作台 无菌二甲基亚砜(DMSO) 针式滤器 (0.22μm PES膜) [NEST] 杯式滤器(0.22μm PES膜) [NEST] 15mL、50mL无菌离心管[NEST] 程序降温盒[NEST] PET/PETG方形试剂瓶[NEST] 移液管[NEST] 自动旋盖机[NEST] 盒装无菌吸头[NEST] 实验准备: 冻存液准备: 一般的细胞:55%基础培养基+40%牛血清(FBS/NBS)+5%DMSO 重要的细胞:90%牛血清(FBS/NBS)+10%DMSO 冻存液配置完成后,15ml离心管分装,4℃条件下储存备用。若配置量较大,可分装入50ml离心管,-20℃条件下冷冻储存。(若牛血清内存在析出沉淀物,采用0.22μm 滤膜过滤除菌) 使用前37℃水浴加热 待冻存细胞: 使细胞冻存前,选择细胞生长状态良好,且处于对数生长期的细胞,冻存前12~24h换新鲜培养基维持细胞状态。 实验流程: 观察待冻存细胞密度,约为80%~90%。用移液枪吸出陈旧培养基,加入无菌PBS清洗细胞1-2次,去除培养环境中的残留培养基。 加入适量对应胰酶或消化液,使胰酶没过细胞,放入培养箱消化。显微镜下观察细胞状态,胞质回缩,细胞间不再连接成片,此时加入完终止液终止消化。 用吸头轻轻吹打细胞,形成细胞悬液,将细胞悬液1000rpm,离心3-5min。丢弃上清,加入适量预先配制好的冻存液,轻轻吹打使细胞均匀并计数。用冻存液调节的细胞密度,使之终密度为5×106/ml~1×107/ml。 用移液枪按照预计容量,分装入细胞冻存管[NEST]中,采用自动旋盖机[NEST]旋盖密封。 标准的冻存程序为降温速率况处-1℃~-2℃/ min,可将待冻存细胞按照以下步骤逐步冻存:室温→4℃(20min)→-20℃(30min)→-80℃(过夜)→液氮长期保存。 也可将待冻存放入程序降温盒[NEST],直接-80℃过夜,再转移至液氮保存。 使用到的NEST产品: 无菌二甲基亚砜(DMSO) 针式滤器 (0.22μm PES膜) [NEST] 杯式滤器(0.22μm PES膜) [NEST] 15mL、50mL无菌离心管[NEST] 程序降温盒[NEST] PET/PETG方形试剂瓶[NEST] 移液管[NEST] 自动旋盖机[NEST] 盒装无菌吸头[NEST] |