与传统ChIP-Seq工作流程比较 [1]
注:与ChIP-Seq研究方法相比,无需交联、超声打断、末端抹平和接头连接等操作,因此更省时,更高效,所需的样品量少。
技术路线
CUT&Tag性能确认测试结果展示 为了对CUT&Tag技术方法做性能确认,华银康高通量测序科研团队分别对样本重复性、最低细胞投入量和同行试剂比对这3个指标进行测试。
1 重复性测试 用3例样本分别进行重复性测试,CUT&Tag质控数据均符合要求,以hg38为参考基因组,F1、F2、F3比对率均在95%以上,序列比对基因组情况均达标。
通过对3例样本测序结果插入片段进行统计,发现3个样本的文库特征峰相似,均符合Tn5酶周期性分布特征,符合重复性要求。
通过对F1、F2、F3这3例样本的测序数据进行IGV可视化展示,发现3个样本的峰信号相似,符合重复性要求。3个样本的reads分布相似,在TSS区域存在明显富集。Peak数量在3个样本中相近,并在较为理想范围内。
F1、F2、F3插入片段统计和reads分布特征
F1、F2、F3这3个样本功能元件分布相似性高,测试结果显示其重复性符合要求。组内样本的相同基因数重合率极高,3个样本motif预测结果50%相似,具有较强的重复性。
F1、F2、F3功能元件分布、组内差异基因和motif韦恩图
2 最低细胞投入量测试 分别对不同细胞投入量的样本进行测试,并使用不同一抗进行富集,以验证测试目的。比如在CTCF三个样本不同细胞投入量的条件下,均可见明显CTCF motif。
CTCF三个样本的motif分析
经测试,符合原始质控数据要求的最低细胞投入量为1万,样本peak数、motif分析等指标内容均达标。
技术优势
1 无需甲醛交联 去交联、DNA打断、标记 实验周期更短 CUT&Tag实验流程中,pA-Tn5酶的使用是一个重要创新[1],这种融合蛋白可以实现与二抗的互作,并能够实现对目标区域的直接切割和标记,从而不再需要对细胞进行甲醛交联和DNA片段化,可将整个实验周期缩短至一天。
CUT&Tag与ChIP-Seq及CUT&RUN比较 [2]
2 信噪比更高 细胞需求量大大降低 CUT&Tag在peak区域展示出远高于ChIP-Seq和CUT&RUN的信号强度,且背景远低于ChIP-Seq。同样由于pA-Tn5酶的使用,CUT&Tag技术可同时完成对目标区域DNA的片段化和测序接头添加,并将片段化产物释放到细胞外。在此过程中,绝大部分非特异性染色质区域还留在细胞核内,因此整个实验的信噪比大幅提高。
使用CUT&Tag、ChIP-Seq及CUT&RUN对多种组蛋白修饰及RNA Pol II的分布进行分析 [3]
3 重复性好 信号富集强 由于整个实验步骤的减少,相比于ChIP-seq和CUT&RUN,CUT&Tag在重复样本之间表现出更高的数据相似度,可重复性高。相关性热图表明,对于H3K4me1这个标记,CUT&Tag的两个重复样品表现出更高的信号组内相关性;在测序数据量相同的情况下,CUT&Tag的peak region内数据量更多,信号更强 [3]。
相关性热图和peak-calling 效率比较
4 能对极少量细胞甚至单细胞进行分析 得益于pA-Tn5酶的高敏感性,CUT&Tag技术可在单细胞水平实现DPI的分析。
single cell CUT&Tag (scCUT&Tag)实验工作流程 [3]
5 Peak在基因功能元件上的分布 为了进一步研究蛋白修饰的结合位点特征,理解蛋白修饰对基因调控的机制,统计peak在各基因功能元件分布个数,使用R包绘制peak在基因功能元件上分布饼图和upset图,比如基因功能元件分布在Promoter、5’UTR、3’UTR。
基因功能元件分布饼图
Peak在基因功能元件上的分布饼图
6 Motif分析 Motif 是具有某种生物特性,在一组相关序列中重复出现的序列模式,是研究基因表达调控机制的重要信息。CUT&Tag所研究的转录因子或组蛋白,其结合位点可能存在特定的序列特征。为尝试得到这种修饰结合的保守序列信息(motif 序列),进一步理解蛋白修饰对基因表达的调控,选取call peak得到的summit上下游250bp的序列进行motif预测。
Motif分析
技术应用
案例解析:ATAC-seq + CUT&Tag+ bulk RNA-seq+ scRNA-seq联合应用,揭示BATF在肺ILC2s细胞中介导组织修复的分子机制
2022年1月14日,威斯康星医学院微生物学和免疫学系Weiguo Cui团队在Science Immunology(IF:17.73)在线发表了题为BATF promotes group 2 innate lymphoid cell–mediated lung tissue protection during acute respiratory virus infection 的研究论文[4]。
文章采用scRNA-seq、bulk RNA-seq、ATAC-seq、CUT&Tag测序,揭示了BATF在诱导ILC2s细胞愈合基因表达并促进组织损伤修复方面的作用机制。该研究利用scRNA-seq确定与病毒侵染后修复的ILC2s亚群,并发现BATF基因可能与抗炎和修复相关;进一步利用bulk RNA-seq分析,确定了BATF与抗炎、细胞增殖等方面的关系;通过ATAC-seq明确BATF促进抗炎、增殖、修复相关基因的染色质开放,并结合CUT&Tag-seq进一步验证结果,为急性病毒感染期间炎症消除提供了潜在的药物治疗靶点。
BATF促进组织修复基因表达并抑制炎症基因
参考文献: [1]Kaya-Okur, H.S., et al., CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Cold Spring Harbor Laboratory, 2019. [2]Tao X, Feng S, Zhao T, Guan X. Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag. Plant Methods. 2020;16:120. Published 2020 Aug 31. doi:10.1186/s13007-020-00664-8. [3]Kaya-Okur HS, Janssens DH, Henikoff JG, Ahmad K, Henikoff S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nat Protoc. 2020;15(10):3264-3283. doi:10.1038/s41596-020-0373-x. [4]Kaya-Okur, H. S., Wu, S. J., Codomo, C. A., Pledger, E. S., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., ... & Henikoff, S. (2019). CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature communications, 10(1), 1930. [5]Wu, X., et al., BATF promotes group 2 innate lymphoid cell–mediated lung tissue protection during acute respiratory virus infection. Science Immunology, 2022. 7(67): p. eabc9934.
助力科研 华银康集团是国内最早开展免疫组库测序的NGS服务商之一,目前已完成上百项免疫组库测序分析项目,拥有丰富的免疫组库项目经验,我们也将继续开发免疫组库相关的测序技术,为医学免疫学研究贡献自己的力量。 --------------------高通量测序检测中心-------------------- 中心定位于科研服务与临床医学转化应用,围绕基础科研和临床检测两大板块, 目前,我司高通量测序中心拥有Illumina和MGI等高通量测序仪组成的大规模高通量测序服务平台,
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