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免疫荧光技术(Immunofluorescence technique)又称荧光抗体技术(IF),是标记免疫技术中发展最早的一种。 它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合,利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。Coons 等于 1941 年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术(fluorescentantibodytechnique)。 用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法;用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术,因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合,用于检测或定位各种抗原,也可以与其他蛋白质结合,用于检测或定位抗体,但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用,所以人们习惯称为荧光抗体技术,或称为免疫荧光技术。以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞(或组织) 化学技术。 该技术的主要特点是:特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是:非特异性染色问题尚未完全解决,结果判定的客观性不足,技术程序也还比较复杂。 荧光免疫法按反应体系及定量方法不同,还可进一步分做若干种。与放射免疫法相比,荧光免疫法无放射性污染,并且大多操作简便,便于推广。国外生产的 TDM 用试剂盒,有相当一部分即属于此类,并且还有 zhuan 供 TDM 荧光偏振免疫分析用的自动分析仪生产。 由于一般荧光测定中的本底较高等问题,荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。近年来发展了几种特殊的荧光免疫测定,与酶免疫测定和放射免疫分析一样,在临床检验中应用。 1、原理 免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性,所以当抗原抗体发生反应时,只要知道其中的一个因素,就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体(或抗原)上,与其相应的抗原(或抗体)结合后,在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。 直接法:将标记的特异性荧光抗体,直接加在抗原标本上,经一定的温度和时间的染色,用水洗去未参加反应的多余荧光抗体,室温下干燥后封片、镜检。 间接法:如检查未知抗原,先用已知未标记的特异抗体(第一抗体)与抗原标本进行反应,用水洗去未反应的抗体,再用标记的抗抗体(第二抗体)与抗原标本反应,使之形成抗原—抗体—抗体复合物,再用水洗去未反应的标记抗体,干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体,则表明抗原标本是已知的,待检血清为第一抗体,其它步骤的抗原检查相同。 标记的抗抗体是抗球蛋白抗体,同于血清球蛋白有种的特异性,如免疫抗鸡血清球蛋白只对鸡的球蛋白发生反应,因此,制备标记抗体适用于鸡任何抗原的诊断。 2、步骤 细胞准备:对单层生长细胞,在传代培养时,将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中,待细胞接近长成单层后取出盖玻片,PBS 洗两次;对悬浮生长细胞,取对数生长细胞,用 PBS 离心洗涤(1000rpm,5 min)2 次,用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 固定:根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的 PBS 中 4℃ 保存 3 个月。PBS 洗涤 3×5 min. 通透:使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞,一般需要在加入抗体孵育前,对细胞进行通透处理,以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在 5-15 min. 通透后用 PBS 洗涤 3×5 min. 封闭:使用封闭液对细胞进行封闭,时间一般为 30 min. 一抗结合:室温孵育 1 h 或者 4℃ 过夜。PBST 漂洗 3 次,每次冲洗 5 min. 二抗结合:间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育 1 h.PBST 漂洗 3 次,每次冲洗 5 min 后,再用蒸馏水漂洗一次。 封片及检测:滴加封片剂一滴,封片,荧光显微镜检查。 3、常见问题 免疫荧光(IF)技术实验常见问题解决:包括背景过高,信号弱或无信号,荧光猝灭快,细胞有自发荧光等。 |