荧光定量 PCR 实验结果不理想?重提了 RNA,再重头来一遍,结果还是一样? 很有可能您忽视了重要步骤,也可能是您还没有选对逆转录的试剂...看着很简单的逆转录,其实暗藏玄机。今天,莫纳丽莎为大家带来了逆转录实验的 tips,干货满满。快快加入我们,一起轻松实现高效的逆转录实验吧! 三代逆转录预混液 (MR05001)
去基因组与逆转录一管化三代预混液 (MR05101)
去基因组与逆转录两步进行的三代预混液(MR05201)
|实验操作| 反转录实验操作步骤 (以 MR05201 为例) ■ 1.试剂融化后稍离心,使用前放置冰(盒)上。 ■ 2.取无菌、无核酸酶的EP管,按下面步骤依次进行去除基因组及逆转录。 ■ 2.1 基因组 DNA 污染去除:
#1 干冰(盒)上配制如下反应体系:
推荐使用试剂盒提取的高质量 RNA 作为模板。 #2 轻柔吸打混匀,瞬离; #3 37℃温育 2 min,以去除基因组 DNA 污染; (*注:若 RNA 中基因组 DNA 污染严重,可适当延长 37℃ 温育时间至 5 min。) #4 可 55℃ 温育 5 min,以使 dsDNase 失活,冰(盒)上放置。 ■ 2.2 cDNA 第一条链合成: #1 干冰(盒)上配制如下反应体系:
#2 轻柔吸打混匀,瞬离; #3 50℃ 温育 15 min; (*注:若目标 RNA 不含 Poly(A) 结构,可预先 25℃ 温育 10 min。) #4 反应结束后,85℃ 温育 5 min 以终止反应; #5 将获得的 cDNA 溶液置于冰上,用于后续实验。 (*注:cDNA 溶液置于 -20℃可保存半年;置于 -80℃可长期储存。) |说明| ■ 使用该预混液,15min 可获得长达 12kb 的 cDNA,可以作为下游 qPCR 或者普通 PCR 扩增的模板,根据实验需要使用原液或者适当稀释后用于后续实验。 ■ 通过试剂盒提取的 RNA 中往往存在着一定程度的基因组 DNA 污染,如果逆转录前不做去除处理,且引物未做跨外显子设计,那么下游进行 qPCR 反应时,基因组 DNA 将很有可能会与 cDNA 一起作为模板进行扩增,导致定量实验结果不准确。 ■ 采用去基因组 DNA 污染与逆转录分开进行的操作方法,提高反转录效率的同时亦可保证不同丰度基因转录的一致性,准确评估 RNA 的表达水平。 |注意事项| 逆转录相关的 RNA 操作需注意: ■ 要有专门划分出的 RNA 实验专区; ■ 使用经过处理的,无 RNA 酶的 EP 管和实验器皿; ■ 始终配戴手套及口罩; ■ 冰(盒)上操作: 提取RNA的样品尽可能是新鲜的或速冻样品(液氮速冻,-80℃保存)保证高质量的完整RNA没有基因组DNA残留和聚合酶抑制剂成分。 |影响因素| 影响逆转录的关键因素: ■ 模板二级结构; ■ 基因组污染除去能力; ■ 不同模板浓度的影响; ■ RNA提纯中的抑制剂; ■ 操作步骤少,污染风险低。 |提高逆转录效率| 方法 1
说明:更高逆转录反应温度-模板在 55℃ 充分打开。 MonScript™ 系列逆转录产品,为满足科研工作者对 cDNA 合成越来越高的需求,以 M-MLV 逆转录酶为基础,通过基因工程改造为更高反应温度 42℃-55℃,与市面上其他逆转录产品相比,拥有更高的逆转录反应温度,cDNA 产量更高,具有更完整的基因代表性。 方法 2
* 1. 不去基因组+逆转录 * 2. 不去基因组+不逆转录 * 3. 去基因组+逆转录 * 4. 去基因组,不逆转录
说明:彻底去除基因组污染,定量结果更准确。 莫纳预混液采用了高效的 dsDNase,该酶具有热敏感性,可在高温条件下快速不可逆地失活。与传统使用 DNase I 去除基因组 DNA 污染的方法相比,dsDNase 无需额外加入 EDTA 进行失活,不仅节省实验时间,而且降低了对逆转录反应的抑制。 方法 3
说明:分别测试不同品牌的逆转录产品的酶动力学范围(绘制标准曲线)。 结果表明:Monad 逆转录产品整体表现稳定且酶动力学范围更广,即对于高浓度的 RNA 可以有效反转,对于低浓度的 RNA 也没有抑制作用。 方法 4
说明:提纯过程中的抑制剂存在对定量结果的影响。 莫纳逆转录产品在抑制剂存在的情况下,对植物样本高、中、低丰度基因扩增仍表现出较好的水平;与其他品牌相比,对抑制剂 SDS 有较好的耐受能力。 方法 5
说明:全预混与半预混的产品形式,更少的加样步骤,更低的污染风险。 配制逆转录反应体系需要逆转录酶、dNTPs、DNase 等,以单组分形式会增加实验更多的操做和污染风险。预混液的形式,可以大大减少加样的操作,节省实验操作时间及降低污染风险,实现简单的操作体验。 |FAQ| 关于逆转录实验的常见问题与解答: Q1:用不同品牌反转录试剂盒反转录后,对 cDNA 进行浓度和纯度测定,发现所得到的 A260/A280 结果不同,不同厂家试剂盒反应的结果不同是什么原因? 反转录本身就含有逆转录酶等蛋白质,再进行反转录后所得到的 cDNA 产品本身并不是纯净,A280 吸收峰会升高。由于不同厂家之间体系内酶的含量不同,因而 A280 的吸收峰也会存在差异,因此,对反转录 cDNA 进行纯度检测没有实际意义。另外,由于反转录酶受到 RNA 纯度的影响,其活性可能存在差异。还有可能会出现反转录后 cDNA 含量偏小的情况,且含有残存的 RNA,对 A260 的吸收峰有影响,同样不适用于浓度检测。 Q2:分析一下反转录 All in one mix(with dsDNase)去基因组 dsDNase 酶为什么消化效果好? 与 DNase I 做比较,包括反应时间,操作步骤,去除效果,失活条件几个方面,所有的 DNA 酶里面,只有 dsDNase 是特异性识别双链 DNA,因此可以彻底去除 RNA 模板中残留的 gDNA 污染。此外,因 DNase I 活性依赖 Ca2+,工作时需二价金属阳离子存在(Mg2+ 或 Mn2+),失活 Buffer 中需添加 EDTA,而 EDTA 对下游实验有抑制性。 Q3:逆转录 All-in-one mix 不推荐进行普通 PCR 的主要原因是什么? 逆转录反应得到的是不同大小片段都有的 cDNA 库,所以说如果得到的 cDNA 库里长片段越多,那么就越能做普通 PCR 长片段扩增,目前最长是以番茄样本测试到了 5kb 的一个片段,没有对其他样本做检测。长片段的普通 PCR 要做的好,那么 cDNA 产物里长片段的量要多,我们对试剂做了优化,就是为了提高长片段 cDNA 的得率,和最长获得 12 kb 的 cDNA 不矛盾。 Q4:逆转录 RNA 模板量的下限? 下限是 50 ng,下游做 PCR 及 qPCR 均可,但如果 qPCR 检测的基因本身是低丰度基因,可能存在检测不出。 以上就是今天关于逆转录实验的干货 Tips 啦!不知道有没有帮助到大家改进自己的实验呢? 你在逆转录实验中都遇到过哪些问题?又是如何解决的呢?欢迎莫粉儿们积极分享自己的经验,畅游科研世界,和莫纳一起探索无限! 您如果有任何问题或者对我们的产品有购买/试用意向, 可联系我们进行咨询哦~风里雨里,我们等你!
1. Arhat/Tarzan 96 梯度 PCR 仪:温度准确、均一,专利技术防边缘蒸发,叠放省空间 2. QuickGel 6200 & Luna 凝胶成像系统:全身不锈,一键成像 3. QuickChemi 5200&Hesper 化学发光成像系统:高灵敏度,维护简单,高颜值,自动成像 4. PlatePro 3200 微孔板离心机:水平大离心力,消泡效果好 5. 定量 PCR Mix:高特异性,兼容多种样本,检测范围宽,完美兼容常见定量 PCR 仪 6. 逆转录预混液:更高反应温度,宽广酶动力范围,彻底去除基因组,全预混液 7. 核酸电泳系列:琼脂糖+ DNA ladder+安全染料+蓝光切胶仪,支持定制 8. 高品质定量 PCR 耗材:进口原材料,十万级洁净车间生产 9. 低温加样系列:低温加样利器,支持整体消毒,超洁净 |